董子漾， 趙江博， 馬 寧， 蔡樂琪， 劉玲玲， 陳德勝

（1.寧夏醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，銀川 750004； 2.寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院骨科，銀川 750004）

人工關(guān)節(jié)置換術(shù)是目前公認(rèn)的治療晚期骨性關(guān)節(jié)炎、股骨頭壞死等疾病的有效方法，可以達(dá)到消除疼痛、矯正畸形、改善功能的目的，大大提高了患者的生活質(zhì)量。隨著關(guān)節(jié)置換患者的增多，假體晚期無菌松動的問題日益凸顯，二次翻新治療給廣大患者無論是經(jīng)濟(jì)還是精神上都帶來嚴(yán)重的創(chuàng)傷。因此通過非手術(shù)方式來預(yù)防和治療人工關(guān)節(jié)置換術(shù)后發(fā)生的無菌性松動一直是關(guān)節(jié)外科的研究熱點。目前研究[1]發(fā)現(xiàn)，導(dǎo)致無菌性關(guān)節(jié)松動的原因可以分為物理因素和生物因素，其中物理因素與手術(shù)操作等有關(guān)，而生物因素則是由于磨損顆粒的作用。本實驗利用超高分子量聚乙稀（UHMWPE）顆粒，將磨損顆粒誘導(dǎo)骨溶解模型和植骨氣囊模型相結(jié)合，模型構(gòu)建完成后，進(jìn)行大體及病理學(xué)染色觀察，為研究假體周圍骨溶解引起的無菌性松動建立更加經(jīng)濟(jì)、有效地貼近臨床的動物模型，為進(jìn)一步的臨床研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

UHMWPE 顆粒（購自西安潤德生物技術(shù)有限公司）；蘇木精-伊紅染液、抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）試劑盒（購自西安潤德生物技術(shù)有限公司）；Masson 麗春紅酸性復(fù)紅液；4%多聚甲醛、叔丁醇、12.5% EDTA、無水乙醇、PBS 液（購自銀川潤研生物技術(shù)有限公司）；3% H2O2；RANK 抗體（購自Abcam 公司）；山羊抗兔IgG（購自北京中杉金橋公司）；蒸餾水，二甲苯，Olympus 顯微鏡、真空烘箱、石蠟包埋機、石蠟切片機，Salfradent 離心加速機，Leica Q-500 圖像分析儀（購自博士德生物工程有限公司）。

1.2 實驗動物

雌性SPF 級BALB/c 小鼠，30 只，健康狀況良好，平均8～10 周齡。5 只/籠飼養(yǎng)于寧夏醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心SPF 級動物房。

1.3 模型制備

30 只雌性BALB/c 小鼠，其中10 只處死后取顱骨骨片，去除骨片周圍軟組織后備用。另外20 只小鼠隨機分為空白對照組和UHMWPE 顆粒刺激組，每組10 只。兩組小鼠分別行氣囊形成術(shù)，即第1 天在小鼠背部皮下注射無菌空氣2 mL，此后每天在同一部位向氣囊內(nèi)注射無菌空氣1 mL，直至第7 天氣囊形成。第8 天，分別切開兩組小鼠背部的氣囊，向其中植入顱骨骨片并縫合切口，制成植骨氣囊模型?？瞻讓φ战M小鼠植骨后氣囊內(nèi)立即注射0.3 mL 無菌PBS 液，UHMWPE 顆粒刺激組小鼠立即注射0.3 mL UHMWPE顆粒（5 mg）。第14 天，處死兩組小鼠，取出空白對照組和UHMWPE 顆粒刺激組氣囊內(nèi)的顱骨骨片及其周圍包裹的囊壁組織，進(jìn)行大體觀察以及病理學(xué)染色觀察[2]。

1.4 病理標(biāo)本的制備

對取出的顱骨及氣囊壁組織置于12.5% EDTA 脫鈣液中脫鈣2 周；脫水、二甲苯透明處理后，再將標(biāo)本浸于石蠟包埋，分組標(biāo)記。將修整好的蠟塊置于石蠟切片機上切片，片厚4 μm。切片漂浮于攤片機40 ℃溫水上將組織展平，用載玻片將組織撈起，并放進(jìn)60 ℃烘箱內(nèi)烤片，待水烤干蠟烤化后取出常溫保存?zhèn)溆?。分別進(jìn)行HE 染色、Masson 與免疫組織化學(xué)雙染法、TRAP 染色，比較UHMWPE 顆粒刺激組與空白對照組炎性細(xì)胞數(shù)目、氣囊壁厚度、破骨細(xì)胞數(shù)目的差異。

1.5 HE 染色行炎性細(xì)胞計數(shù)

取顱骨及其囊壁組織固定，石蠟包埋，制成切片，用二甲苯脫蠟，經(jīng)各級乙醇至水洗，蘇木精染色、水洗，鹽酸乙醇分化、水洗，氨水返藍(lán)、水洗，伊紅染色、水洗，又經(jīng)乙醇、二甲苯脫水透明后樹脂封固。

對標(biāo)本各隨機采集10 個視野，采用Olympus DP70 顯微鏡系統(tǒng)（購自日本Olympus 公司）拍攝照片，圖像采用Image Pro Plus 5.0 軟件（購自美國Media CyberneTics 公司）分析，計算UHMWPE 顆粒刺激組與空白對照組的炎性細(xì)胞數(shù)目（個/mm2）平均值。

1.6 利用Masson 與免疫組織化學(xué)雙染法測量氣囊壁厚度

將上述石蠟切片脫蠟，鉻化處理后，用蒸餾水沖洗，首先進(jìn)行免疫組化染色：3%H2O2封閉內(nèi)源性過氧化物酶（室溫避光，10 min），蒸餾水洗5 min（2 次），抗原修復(fù)，PBS 液5 min（2 次），從染片缸中取出切片，擦凈切片背面水分及切片正面組織周圍的水分，滴加正常山羊血清處理（37 ℃，15 min），滴加RANK 抗體（37 ℃，2 h），再次PBS液5 min（2 次），滴加山羊抗兔IgG（37 ℃，40 min），PBS 液5 min（2 次），DAB 顯色，鏡下觀察，蒸餾水充分沖洗后蘇木精復(fù)染（室溫，30 s），沖洗返藍(lán)（15 min），梯度酒精脫水，二甲苯透明處理。

在免疫組化染色的基礎(chǔ)上再進(jìn)行Masson 套染：先用Regaud 蘇木精染液染核5～10 min，經(jīng)充分水洗后，再用Masson 麗春紅酸性復(fù)紅液5～10 min。分別以2%冰醋酸水溶液浸洗片刻，1%磷鉬酸水溶液分化3～5 min。不經(jīng)水洗，直接用苯胺藍(lán)染5 min。再以0.2%冰醋酸水溶液浸洗片刻，最后用中性樹膠封片[3]。標(biāo)本攝片后利用軟件分析（方法同上），測量氣囊壁厚度（μm）。

1.7 利用TRAP 染色行破骨細(xì)胞計數(shù)

首先將切片脫蠟，依據(jù)美國Genmed scientifics 公司TRAP 染色試劑盒說明書順序進(jìn)行，最后進(jìn)行脫水封片。

標(biāo)本攝片后利用軟件分析（方法同上），對顱骨組織行破骨細(xì)胞計數(shù)，并分別計算每高倍鏡（×40）視野下UHMWPE 顆粒刺激組與空白對照組的破骨細(xì)胞數(shù)平均值。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 23.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用兩個獨立樣本的t檢驗。P≤0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大體觀察

手術(shù)切開背部氣囊壁，進(jìn)行大體觀察，可見UHMWPE 顆粒刺激組中囊壁組織明顯充血水腫，且囊壁較厚，空白對照組中囊壁組織未見明顯水腫，囊壁光滑且較薄。

2.2 兩組小鼠炎性細(xì)胞計數(shù)比較

UHMWPE 顆粒刺激組可見骨小梁結(jié)構(gòu)紊亂，有明顯的骨溶解現(xiàn)象及炎癥反應(yīng)過程，可見大量胞核深染的炎性細(xì)胞；空白對照組骨溶解現(xiàn)象不明顯，骨小梁結(jié)構(gòu)規(guī)則，炎性細(xì)胞較少（圖1）。經(jīng)過細(xì)胞計數(shù)，UHMWPE 顆粒刺激組炎性細(xì)胞（7565.45±285.94）（個/mm2）多于空白對照組的（6017.95±184.02）（個/mm2）（t=-20.35，P＜0.001）。

2.3 兩組小鼠氣囊壁厚度比較

UHMWPE 顆粒刺激組顱骨及囊壁組織內(nèi)可見較多被染成棕色的RANK 蛋白，提示破骨細(xì)胞大量增殖活化，骨溶解過程發(fā)生；而空白對照組上述表現(xiàn)不明顯（圖2）。UHMWPE 顆粒刺激組氣囊壁的厚度［（186.85±24.30）μm］大于空白對照組［（157.75±17.56）μm］（t=-4.34，P＜0.001）。

2.4 兩組小鼠破骨細(xì)胞計數(shù)比較

圖3 可見被染成酒紅色的破骨細(xì)胞，每高倍鏡（×40）視野下UHMWPE 顆粒刺激組破骨細(xì)胞計數(shù)［（15.25±1.86）個］多于空白對照組［（2.55±0.94）個］（t=-27.22，P＜0.001）。

3 討論

1999 年Merkel 等[4]首先使用磨損顆粒誘導(dǎo)骨溶解的顱骨模型，2004 年Ren 等[5]首先采用小鼠氣囊模型來進(jìn)行人工關(guān)節(jié)無菌性松動的研究。目前的骨溶解模型主要包括磨損顆粒誘導(dǎo)骨溶解模型和植骨氣囊模型，但兩者均存在各自的局限性。本實驗將上述兩種模型進(jìn)行有機結(jié)合，既保留氣囊模型對軟組織的良好模擬效果，又便于發(fā)揮磨損顆粒的誘導(dǎo)作用，并且最終通過大體觀察、HE 染色、Masson 與免疫組織化學(xué)雙染、TRAP染色四種方法綜合評價模型構(gòu)建的效果。

既往磨損顆粒的選擇以鈦顆粒為主，本模型選用UHMWPE 顆粒來模擬人工假體關(guān)節(jié)面之間所產(chǎn)生的磨損顆粒，UHMWPE 具有優(yōu)良的生物相容性、耐腐蝕性，更重要的是目前正廣泛應(yīng)用于臨床人工關(guān)節(jié)假體植入術(shù)[6-8]。

UHMWPE 顆粒可刺激氣囊壁的界膜組織增生，并被巨噬細(xì)胞吞噬，刺激其釋放一系列的細(xì)胞因子，激活RANKL/RANK 等信號通路，促進(jìn)破骨細(xì)胞的產(chǎn)生與成熟，促使成骨細(xì)胞增殖能力減弱甚至凋亡，從而誘導(dǎo)骨溶解以及無菌性松動的發(fā)生。

模型構(gòu)建完成后，將氣囊組織切開，可見顱骨組織被界膜組織形成的囊壁以及皮膚和皮下組織所包裹，對取出的氣囊壁和顱骨組織進(jìn)行大體觀察，可見UHMWPE 顆粒刺激組顱骨周圍囊壁組織較空白對照組明顯充血水腫，且囊壁較厚，提示有炎癥反應(yīng)過程。HE 染色中，UHMWPE顆粒刺激組內(nèi)可見大量炎性細(xì)胞浸潤，且骨小梁結(jié)構(gòu)不規(guī)則，有明顯的骨溶解現(xiàn)象，通過對炎性細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)，發(fā)現(xiàn)UHMWPE 顆粒刺激組多于空白對照組；Masson 與免疫組化雙染法可發(fā)現(xiàn)UHMWPE 顆粒刺激組內(nèi)存在較多被染成棕色的RANK 蛋白，表明RANKL/RANK 通路被激活，破骨細(xì)胞大量增殖與分化及其數(shù)量明顯增多，且測得UHMWPE 顆粒刺激組內(nèi)氣囊壁厚度大于空白對照組；TRAP 染色可以將破骨細(xì)胞染成酒紅色，UHWMPE 刺激組內(nèi)的破骨細(xì)胞數(shù)也多于空白對照組。提示UHMWPE 顆粒刺激組炎細(xì)胞廣泛增殖、破骨細(xì)胞分化成熟、氣囊壁界膜組織增生，發(fā)生了骨吸收過程與慢性炎癥反應(yīng)，與臨床上無菌性松動的病理生理過程相契合，進(jìn)而可以證明UHMWPE 誘導(dǎo)小鼠植骨氣囊骨溶解模型基本構(gòu)建成功[9-13]。

當(dāng)然此模型仍具有一些不足，首先，UHMWPE 材料磨損顆粒密度低，不易調(diào)配成均勻的混合液。其次，本模型僅僅模擬了病理狀態(tài)下磨損顆粒對骨溶解的誘導(dǎo)作用，但對于其他物理生物因素缺乏嚴(yán)謹(jǐn)全面的闡述[14-15]。

雖然具有上述的局限性，但本模型成功地將植骨氣囊模型與磨損顆粒誘導(dǎo)骨溶解模型相結(jié)合，并且引入了UHMWPE 材料模擬磨損顆粒，通過大體觀察以及三種病理染色來評價模型構(gòu)建的效果，較之前的模型更加經(jīng)濟(jì)、有效地模擬了臨床上人工假體的無菌性松動。