陳濤，李麗，姚啟盛，李昊，陳從波，楊勇，王黎

0 引言

腎癌是起源于腎實質(zhì)泌尿小管上皮系統(tǒng)的惡性腫瘤，發(fā)病率僅次于膀胱癌，但死亡率位居泌尿生殖系統(tǒng)首位，占成人全部惡性腫瘤的2%～3%[1]。腎癌對放化療治療效果不明顯，手術(shù)為其主要治療方式，其中以腹腔鏡手術(shù)為首選。腎癌同其他惡性腫瘤一樣，術(shù)后存在一定復(fù)發(fā)率，但缺乏可靠標(biāo)志物。循環(huán)腫瘤細(xì)胞（circulating tumor cell,CTC）是指從原發(fā)或繼發(fā)腫瘤灶的不同部位脫落，在各種細(xì)胞因子作用下進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)，可以在患者外周血檢測到異質(zhì)性腫瘤細(xì)胞。近年來研究發(fā)現(xiàn)循環(huán)腫瘤細(xì)胞在監(jiān)測腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移等方面具有非常重要的作用，目前已成為討論的熱點(diǎn)[2]。本文旨在探討術(shù)后循環(huán)腫瘤細(xì)胞的變化與腎癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移之間的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

將十堰市太和醫(yī)院2014年1月—9月收治的41例局限性腎癌患者納入研究。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）年齡18～70歲，性別不限；（2）病檢示pT1bN0M0的腎癌，行部分切除手術(shù)；（3）手術(shù)后能配合長期隨訪，并同患者及其家屬簽訂隨訪同意書；（4）隨訪期間出現(xiàn)復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移的局限性腎癌患者必須存有病理診斷（本院和外院均可）。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）不能配合或者有精神系統(tǒng)疾病或者合并其他器官及組織癌癥患者；（2）隨訪期間出現(xiàn)其他腫瘤（不包含腎轉(zhuǎn)移癌）；（3）腎臟合并其他疾病患者，如炎性反應(yīng)及發(fā)熱等全身疾病、急慢性腎小球腎炎、IgA腎病、SLE系統(tǒng)性紅斑狼瘡、腎鹿角狀結(jié)石等。納入41例患者中，陽性組（CTC術(shù)后3月≥CTC術(shù)前）平均年齡（57.8±11.9）歲，其中男14例，女9例；陰性組（CTC術(shù)后3月＜CTC術(shù)前）平均年齡（58.9±11）歲，其中男11例，女7例。相關(guān)操作均經(jīng)患者及家屬同意并且通過醫(yī)院倫理委員會審查。

1.2 方法

1.2.1 數(shù)據(jù)收集 收集患者年齡、性別、手術(shù)方式、病理診斷以及TNM分期、復(fù)發(fā)患者影像學(xué)資料及病理診斷、術(shù)前和術(shù)后3月循環(huán)腫瘤細(xì)胞數(shù)值、隨訪期間出現(xiàn)腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的時間。

1.2.2 循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測方法 術(shù)前和術(shù)后3月分別采集7.5 ml腎癌患者外周靜脈血至ACD抗凝血管中。（1）去除血清：常溫800 g離心8 min，去除上層血清，保留下層血細(xì)胞；（2）去除紅細(xì)胞：50 ml離心管中加入3 ml樣本密度分離液，在樣本密度分離液上層疊加血細(xì)胞，450 g離心8 min后，將含有白細(xì)胞和CTCs的白膜層吸到新的50 ml離心管中；（3）去除白細(xì)胞：在放有白細(xì)胞混液的離心管中加入處理好的200 μl磁珠，將離心管傾斜約30°置于搖床上，130 r/min，搖動20 min，450 g離心8 min，然后去除白細(xì)胞和磁珠混合物，吸取上清液至新的15 ml離心管中，加入清洗液清洗后棄上清液至50 μl；（4）液染抗體：加入2 μl抗原修復(fù)液，10 min后加入anti-CD45、anti-CK18抗體和抗體稀釋液的混合液，室溫避光孵育20 min，650 g離心5 min，棄上清液至100 μl；（5）固定和涂片：混勻細(xì)胞沉淀后加入100 μl固定液混勻、涂片，過夜烘干玻片；（6）CTC的雜交和分析：烘干的玻片經(jīng)過晾置、雜交洗液清洗和無水乙醇洗滌、脫水后，進(jìn)行CEP8探針雜交。雜交條件為76℃變性10 min，37℃雜交4 h。清洗液清洗后滴加5 μl DAPI染液封片并于熒光顯微鏡下觀察。

1.2.3 循環(huán)腫瘤細(xì)胞鑒定方法 顯微鏡下見細(xì)胞呈橢圓形、圓形或者長方形，細(xì)胞形態(tài)及邊緣完整，可見完整細(xì)胞核結(jié)構(gòu)。應(yīng)用差減富集-熒光免疫染色原位雜交技術(shù)（SE-iFISH）進(jìn)行檢測，樣本應(yīng)符合CK+/CD45-/DAPI+/CEP8=2或CK+/CD45-/DAPI+/CEP8＞2或CK-/CD45-/DA PI+/CEP8＞2可判定為循環(huán)腫瘤細(xì)胞。以上檢測由2名或者多名研究人員同時鑒定。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS22.0軟件對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，采用t檢驗比較不同組別之間的差異。計數(shù)資料采用χ2檢驗比較不同組別之間差異。生存率采用Kaplan-Meier計算，組間整體生存率的比較使用Log rank檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者一般臨床資料分析

陽性組和陰性組局限性腎癌患者的性別、年齡、腰痛、腫瘤位置、病理類型差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

表1 兩組患者一般臨床資料Table 1 Clinical data of two groups of localized renal carcinoma patients

2.2 兩組局限性腎癌患者復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移之間的差異比較

41例局限性腎癌患者中，陽性組（n=23）出現(xiàn)10例復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率為43.5%；陰性組（n=18）出現(xiàn)2例復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率為11.1%，兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.024）。

2.3 兩組局限性腎癌患者5年生存差異分析

陽性組5年生存率為58%，陰性組5年生存率為88.9%。Log rank檢驗結(jié)果顯示兩組生存率差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.048），見圖1。

圖1 兩組局限性腎癌患者5年總生存率比較Figure 1 Comparison of 5-year overall survival between positive group and negative group

3 討論

腎癌是泌尿系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，近年來發(fā)病率呈上升趨勢，對放化療治療不敏感，手術(shù)治療可提高其生存率，但仍有20%～30%患者術(shù)后出現(xiàn)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，最終導(dǎo)致死亡[3-4]。既往由于腎癌術(shù)后缺乏能進(jìn)行監(jiān)測的特異性標(biāo)志物，只能常規(guī)依靠影像學(xué)技術(shù)，然而目前現(xiàn)有影像技術(shù)只能發(fā)現(xiàn)0.5～1 cm病灶[5]。因此尋找一種指標(biāo)用于腎癌術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移風(fēng)險的評估和腫瘤微病灶的診斷顯得尤為重要。自1869年澳大利亞籍醫(yī)生Thomas Ashworth在1例死亡患者體內(nèi)發(fā)現(xiàn)CTC以來，腫瘤液體活檢拉開了序幕。隨后幾年里研究發(fā)現(xiàn)循環(huán)腫瘤細(xì)胞在監(jiān)測腎癌早期復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移方面具有重要作用[6]。由于局限性腎癌患者術(shù)后并非都會出現(xiàn)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，同時循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測費(fèi)用昂貴，所以對每位患者術(shù)后均進(jìn)行長期監(jiān)測，不僅增加患者經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，也造成過度醫(yī)療。因此篩選出高危人群進(jìn)行監(jiān)測，是當(dāng)前需解決的熱點(diǎn)問題。

當(dāng)前循環(huán)腫瘤細(xì)胞作為惡性腫瘤預(yù)后監(jiān)測的指標(biāo)已達(dá)到共識。例如，有研究將前列腺癌患者治療后每7.5 ml血液中循環(huán)腫瘤細(xì)胞數(shù)目不小于5作為預(yù)后較差的指標(biāo)，同時發(fā)現(xiàn)治療后循環(huán)腫瘤細(xì)胞數(shù)目下降30%可以延長生存期[7]。Chemi等[8]報道在肺癌患者中循環(huán)腫瘤細(xì)胞數(shù)值增加，腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的風(fēng)險增加。Riethdorf等[9]報道乳腺癌患者循環(huán)腫瘤細(xì)胞數(shù)值不同、無進(jìn)展生存期及總生存期不同，說明循環(huán)腫瘤細(xì)胞變化影響腫瘤患者預(yù)后。龐明輝等[10]探討了88例結(jié)直腸癌患者術(shù)后循環(huán)腫瘤細(xì)胞變化趨勢與腫瘤復(fù)發(fā)之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)術(shù)后循環(huán)腫瘤細(xì)胞持續(xù)升高，腫瘤復(fù)發(fā)可能性非常大。然而，有報道提示在腎細(xì)胞癌中初始循環(huán)腫瘤細(xì)胞數(shù)目與腎癌術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移不存在關(guān)系，而與循環(huán)腫瘤細(xì)胞變化趨勢存在相關(guān)性[11]。Nagaya等[12]報道了一位72歲腎癌患者行舒尼替尼治療后病灶減小，與循環(huán)腫瘤細(xì)胞計數(shù)降低存在正相關(guān)性。本研究發(fā)現(xiàn)陽性組局限性腎癌患者術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率為43.5%，陰性組為11.1%，兩組差異有統(tǒng)計學(xué)意義。同時陽性組5年生存率為58.0%，陰性組為88.9%，兩組存在明顯差異，進(jìn)一步說明局限性腎癌患者手術(shù)治療后若循環(huán)腫瘤細(xì)胞數(shù)目增加，提示腫瘤容易出現(xiàn)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，同時具有更低的生存率。因此，對于此類患者臨床醫(yī)師需高度警惕，同時也應(yīng)告知患者術(shù)后規(guī)律復(fù)查病情。

綜上所述，若局限性腎癌患者術(shù)后循環(huán)腫瘤細(xì)胞數(shù)目增加，提示腫瘤易出現(xiàn)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，同時具有更低的5年生存率。本研究進(jìn)一步證實循環(huán)腫瘤細(xì)胞數(shù)目變化將會成為局限性腎癌患者術(shù)后較好的監(jiān)測指標(biāo)。然而本研究也存在一定局限性，隨訪終點(diǎn)時間不長，未能更長時間監(jiān)測循環(huán)腫瘤細(xì)胞數(shù)目，以及樣本量不多。后期將繼續(xù)隨訪并納入更多的樣本進(jìn)行討論。