蘇嘉慶，李智偉，萬(wàn)召娟，王芳華，汪夢(mèng)，張恒陽(yáng)，張慧欣，周百靈

0 引言

乳腺癌是危及女性健康最常見(jiàn)的一種惡性疾病[1]。在接受手術(shù)、化療等治療方式之后仍易復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移。而且，乳腺癌是高度異質(zhì)性癌癥，不同患者乳腺癌組織的免疫表型、組織形態(tài)、治療反應(yīng)和預(yù)后等均存在較大差異。乳腺癌現(xiàn)有的腫瘤標(biāo)志物還不能滿足臨床需求，亟需發(fā)現(xiàn)新的腫瘤標(biāo)志物，以實(shí)現(xiàn)乳腺癌的個(gè)體化精準(zhǔn)治療[2]。

研究發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)鏈非編碼RNA（LncRNA）的表達(dá)水平與乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展甚至是診療、預(yù)后密切相關(guān)[3-4]，這為我們治療乳腺癌提供了新的線索。近年來(lái)由于高通量技術(shù)的快速發(fā)展，腫瘤領(lǐng)域產(chǎn)生了大量的高通量測(cè)序數(shù)據(jù)和表達(dá)譜數(shù)據(jù)，而且，研究人員已建立了諸多關(guān)于癌癥的重要數(shù)據(jù)庫(kù)，如：ONCOMINE[5]、TCGA[6]等。

通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)[7-8]檢索LncRNA相關(guān)的文獻(xiàn)，本文選取EGOT、MEG3、KCNQ1OT1和NEAT1四種與乳腺癌關(guān)系報(bào)道極少的LncRNA，通過(guò)UALCAN[9]網(wǎng)站挖掘TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中的相關(guān)數(shù)據(jù)分析它們與不同乳腺癌患者的關(guān)系，通過(guò)Kaplan-Meier Plotter網(wǎng)站[10]分析它們與乳腺癌患者預(yù)后的關(guān)系，通過(guò)LinkedOmics網(wǎng)站[11]和ClueGO工具分析與它們表達(dá)相關(guān)的蛋白質(zhì)的主要功能，為乳腺癌的精準(zhǔn)治療、靶向治療以及預(yù)后評(píng)估提供線索。

1 資料與方法

1.1 LncRNA在乳腺癌中的表達(dá)分析

通過(guò)UALCAN（http://ualcan.path.uab.edu/analysis.html）網(wǎng)站對(duì)四種LncRNA在乳腺癌組織與正常組織中的表達(dá)進(jìn)行分析。UALCAN網(wǎng)站可以在線對(duì)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中的數(shù)據(jù)進(jìn)行深入挖掘，不僅可以對(duì)基因在癌癥組織和正常組織中的差異表達(dá)進(jìn)行分析，還可以比較不同臨床病理特征的患者之間的表達(dá)差異，比如年齡、種族、癌癥分期、亞型等，并給出統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)結(jié)果。TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)，即腫瘤基因組圖譜計(jì)劃，目前共收錄33種癌癥的高通量測(cè)序數(shù)據(jù)和患者的性別、年齡、腫瘤分期、復(fù)發(fā)及預(yù)后情況等臨床信息。

1.2 LncRNA與乳腺癌預(yù)后的關(guān)系分析

通過(guò)Kaplan-Meier Plotter（http://kmplot.com/analysis/）網(wǎng)站對(duì)四種LncRNA與乳腺癌預(yù)后的關(guān)系進(jìn)行分析，得到乳腺癌患者的無(wú)復(fù)發(fā)生存時(shí)間（relapse-free survival,RFS）與LncRNA表達(dá)量的Kaplan-Meier圖，并且圖中給出Log rank檢驗(yàn)的P值。若P＜0.05，說(shuō)明LncRNA表達(dá)量與乳腺癌患者的預(yù)后顯著相關(guān)。

1.3 與LncRNA表達(dá)相關(guān)的蛋白質(zhì)分析

通過(guò)LinkedOmics網(wǎng)站分析與LncRNA表達(dá)具有相關(guān)性的蛋白質(zhì)，并獲得與LncRNA表達(dá)極顯著相關(guān)（P＜0.01）的蛋白質(zhì)。然后，使用Cytoscape軟件中的ClueGO工具進(jìn)行GO功能注釋和KEGG通路富集分析，探尋LncRNA與乳腺癌發(fā)生相關(guān)的分子機(jī)制。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

不同組間LncRNA的表達(dá)差異比較使用T檢驗(yàn)。Kaplan-Meier方法進(jìn)行生存分析，生存率的比較采用Log rank檢驗(yàn)。Pearson相關(guān)系數(shù)分析LncRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)相關(guān)性。使用超幾何富集分析方法對(duì)與LncRNA表達(dá)相關(guān)的蛋白質(zhì)進(jìn)行GO功能注釋和KEGG通路富集分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LncRNA在乳腺癌患者中的表達(dá)水平

UALCAN數(shù)據(jù)庫(kù)共有1 097個(gè)乳腺癌組織樣本及114個(gè)正常組織樣本。按患者的種族分類，白種人患者樣本748個(gè)，黑種人患者樣本179個(gè)，黃種人患者樣本61個(gè)。按患者的性別分類，男性患者僅有12例，女性患者為1 075例。按患者的年齡段分類，21～40歲97例，41～60歲505例，61～80歲431例，81～100歲54例。

結(jié)果表明，EGOT在乳腺癌組織中的表達(dá)顯著低于正常組織（P=0.0494），見(jiàn)圖1A。在對(duì)不同種族的乳腺癌患者進(jìn)行分析時(shí)，發(fā)現(xiàn)除白種人外，黑種人（P=0.0001）和黃種人（P=0.0003）乳腺癌組織中EGOT的表達(dá)水平顯著低于正常組織，見(jiàn)圖1B。女性患者癌組織中EGOT的表達(dá)水平顯著低于正常組織（P=0.0045），見(jiàn)圖1C。EGOT在21～40歲（P=0.0391）、81～100歲患者癌組織中的表達(dá)水平顯著低于正常組織（P=0.0313），而其他年齡段與正常組織沒(méi)有顯著差異，見(jiàn)圖1D。

MEG3 在乳腺癌組織中的表達(dá)顯著低于正常組織（P＜1×1 0-12），見(jiàn)圖2 A。白種人（P=1.62×10-12）、黑種人（P=2.83×10-12）和黃種人（P=1.62×10-12）乳腺癌組織中MEG3的表達(dá)水平均顯著低于正常組織，見(jiàn)圖2B。男性（P=0.0001）與女性患者（P=1.62×10-12）中MEG3的表達(dá)水平均顯著低于正常組織，但男女患者之間沒(méi)有顯著差異，見(jiàn)圖2C。MEG3在所有年齡段患者癌組織中的表達(dá)水平均顯著低于正常組織（P＜0.01），見(jiàn)圖2D。

雖然KCNQ1OT1在乳腺癌組織中的表達(dá)水平與正常組織無(wú)顯著差異，但是在黑種人癌組織中的表達(dá)水平顯著低于正常組織（P=4.19×10-5），見(jiàn)圖3A。女性患者KCNQ1OT1的表達(dá)水平與正常組織比較無(wú)顯著差異，但男性患者KCNQ1OT1的表達(dá)水平顯著低于正常組織（P=0.0230），見(jiàn)圖3B。KCNQ1OT1在不同年齡段的乳腺癌患者中的表達(dá)水平與正常組織中的無(wú)顯著差異。

雖然NEAT1在乳腺癌組織中的表達(dá)水平與正常組織中無(wú)顯著差異，但在黃種人患者中的表達(dá)水平顯著低于正常組織（P=3.63×10-6），見(jiàn)圖4A。在21～40歲患者（P=1.98×10-10）和41～60歲患者（P=0.0024）中的表達(dá)水平顯著低于正常組織，見(jiàn)圖4B。

2.2 LncRNA在不同臨床病理特征乳腺癌患者中的表達(dá)情況

由于UALCAN數(shù)據(jù)庫(kù)中部分患者的信息不完整，按臨床分期：Ⅰ期乳腺癌樣本有183個(gè)，Ⅱ期樣本有615個(gè)，Ⅲ期樣本有247個(gè)，Ⅳ期樣本有20個(gè)；按照分子分型：Luminal型、HER2陽(yáng)性和三陰性乳腺癌分別有566、37和116個(gè)樣本；按照組織學(xué)分型：浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌有784個(gè)樣本，浸潤(rùn)性小葉癌203個(gè)樣本，黏液癌17個(gè)樣本，化生性乳腺癌9個(gè)樣本，髓樣癌6個(gè)樣本。

EGOT的表達(dá)水平在Ⅲ期（P=0.0005）和Ⅳ期乳腺癌（P=0.0035）中的表達(dá)水平顯著低于正常組織，見(jiàn)圖5A。HER2陽(yáng)性乳腺癌（P=1.62×10-12）和三陰性乳腺癌組織（P=1.02×10-11）中EGOT的表達(dá)水平顯著低于正常組織，也顯著低于Luminal型乳腺癌（ER、PR陽(yáng)性）（P=4.20×10-12），見(jiàn)圖5B。此外，在不同組織學(xué)亞型中，EGOT在浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌（P=0.0318）、黏液癌（P=2.02×10-10）、化生性乳腺癌（P=1.62×10-12）、髓樣癌（P=0.0002）中的表達(dá)水平顯著低于正常組織，見(jiàn)圖5C。

MEG3的表達(dá)水平在不同分期、不同分子分型的乳腺癌組織中均顯著低于正常組織（P＜0.05），見(jiàn)圖5D～5E。在不同組織學(xué)亞型中，MEG3在浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌（P＜1×10-12）、浸潤(rùn)性小葉癌（P=0.0002）、黏液癌（P＜1×10-12）、髓樣癌（P=1.38×10-9）幾種亞型中的表達(dá)水平顯著低于正常組織，見(jiàn)圖5F。

KCNQ1OT1在不同分期乳腺癌組織中的表達(dá)水平與正常組織無(wú)顯著差異。在不同分子分型中，僅HER2陽(yáng)性乳腺癌中KCNQ1OT1的表達(dá)水平顯著低于正常組織（P=0.0031），見(jiàn)圖6A。KCNQ1OT1在黏液癌（P=0.0367）和髓樣癌（P=0.0091）兩種組織學(xué)亞型中的表達(dá)水平顯著低于正常組織（P＜0.05），見(jiàn)圖6B。

NEAT1在Ⅳ期乳腺癌患者中的表達(dá)水平顯著低于正常組織（P=0.0036），見(jiàn)圖6C。HER2陽(yáng)性（P=1.89×10-12）和三陰性乳腺癌患者（P＜1×10-12）NEAT1的表達(dá)水平顯著低于正常組織，見(jiàn)圖6D。NEAT1在浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌（P=0.0007）、浸潤(rùn)性小葉癌（P=0.0110）和髓樣癌（P=3.81×10-8）三種組織學(xué)亞型中的表達(dá)水平顯著低于正常組織，見(jiàn)圖6E。

圖1 EGOT在乳腺癌及正常組織中的表達(dá)Figure 1 Expression of EGOT in breast cancer and normal samples

圖2 MEG3在乳腺癌及正常組織中的表達(dá)Figure 2 Expression of MEG3 in breast cancer and normal samples

圖3 KCNQ1OT1在乳腺癌及正常組織中的表達(dá)Figure 3 Expression of KCNQ1OT1 in breast cancer and normal samples

圖4 NEAT1在乳腺癌及正常組織中的表達(dá)Figure 4 Expression of NEAT1 in breast cancer and normal samples

圖5 EGOT和MEG3在不同臨床病理特征乳腺癌患者中的表達(dá)Figure 5 Expression of EGOT and MEG3 in breast cancer patients with different clinicopathological characteristics

2.3 LncRNA表達(dá)水平與乳腺癌患者預(yù)后的關(guān)系

Kaplan-Meier曲線顯示EGOT表達(dá)水平高的乳腺癌患者較EGOT表達(dá)水平低的患者有更好的RFS（P=0.037），即更好的預(yù)后，見(jiàn)圖7A。同樣，MEG3（P=1.3×10-8）、KCNQ1OT1（P=8.6×10-8）、NEAT1（P＜1×10-16）的表達(dá)水平與乳腺癌患者的RFS均顯著相關(guān)，而且這三種LncRNA高水平表達(dá)時(shí)，乳腺癌患者的RFS和預(yù)后相對(duì)較好，見(jiàn)圖7B～7D。

2.4 與LncRNA表達(dá)相關(guān)的蛋白質(zhì)分析

圖6 KCNQ1OT1和NEAT1在不同臨床病理特征乳腺癌患者中的表達(dá)Figure 6 Expression of KCNQ1OT1 and NEAT1 in breast cancer patients with different clinicopathological characteristics

與EGOT、MEG3、KCNQ1OT1和NEAT1表達(dá)相關(guān)性最大的前五個(gè)蛋白質(zhì)，見(jiàn)表1。GO功能注釋和KEGG通路富集分析結(jié)果見(jiàn)圖8。

與EGOT表達(dá)相關(guān)的蛋白質(zhì)經(jīng)過(guò)功能富集分析后，共獲得71項(xiàng)極顯著（P＜0.01）的GO term，其中50%與基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控有關(guān)，20.83%與翻譯有關(guān)，見(jiàn)圖8A；獲得1條極顯著（P=0.009）的KEGG通路，與RNA運(yùn)輸相關(guān)的通路。與MEG3表達(dá)相關(guān)的蛋白質(zhì)經(jīng)過(guò)功能富集分析后，共獲得90項(xiàng)極顯著（P＜0.01）的GO term，其中24.21%與細(xì)胞外基質(zhì)組織有關(guān)，其次10.53%與細(xì)胞基質(zhì)黏附相關(guān)，見(jiàn)圖8B；獲得5條極顯著（P＜0.01）的KEGG通路，分別是與黏著斑、細(xì)胞外基質(zhì)與受體相互作用、DNA復(fù)制等相關(guān)的通路。與KCNQ1OT1表達(dá)相關(guān)的蛋白質(zhì)經(jīng)過(guò)功能富集分析后，共獲得13項(xiàng)極顯著（P＜0.01）的GO term，其中30.77%與細(xì)胞器有關(guān)，30.77%的與膜包圍的內(nèi)腔相關(guān)，見(jiàn)圖8C。與NEAT1表達(dá)相關(guān)的蛋白質(zhì)經(jīng)過(guò)功能富集分析后，共獲得25項(xiàng)極顯著（P＜0.01）的GO term，其中28%與肽運(yùn)輸有關(guān)，其次16%與DNA幾何變化相關(guān)，見(jiàn)圖8D。

表1 與LncRNA表達(dá)相關(guān)的蛋白質(zhì)Table 1 Proteins related to expression of four lncRNAs

圖7 LncRNA表達(dá)水平與乳腺癌患者的生存曲線Figure 7 LncRNA expression and Kaplan-Meier curve of breast cancer patients

3 討論

乳腺癌是一種異質(zhì)性癌癥，同樣的治療方案用在不同患者身上，往往有不同的治療效果與預(yù)后，因此需要針對(duì)每種乳腺癌亞型開(kāi)發(fā)特異的腫瘤標(biāo)志物，以便更精準(zhǔn)地個(gè)性化治療與預(yù)后評(píng)估。

本研究發(fā)現(xiàn)EGOT在乳腺癌組織中的表達(dá)顯著低于正常組織。同時(shí)，EGOT的表達(dá)水平在Ⅲ期和Ⅳ期、HER2陽(yáng)性和三陰性乳腺癌、浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌、黏液癌、化生性乳腺癌、髓樣癌等乳腺癌亞型中顯著降低。Kaplan-Meier曲線顯示EGOT表達(dá)水平與患者預(yù)后顯著相關(guān)，表達(dá)水平高的乳腺癌患者較EGOT表達(dá)水平低的患者有更好的預(yù)后。有報(bào)道發(fā)現(xiàn)EGOT在乳腺癌中表達(dá)下調(diào)[12]。與乳腺癌中低表達(dá)類似，有研究發(fā)現(xiàn)在腎細(xì)胞瘤中EGOT表達(dá)下調(diào)并起到腫瘤抑制因子的作用[13]。通過(guò)功能富集分析，發(fā)現(xiàn)與EGOT表達(dá)相關(guān)的蛋白質(zhì)主要與基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控、翻譯和RNA運(yùn)輸?shù)认嚓P(guān)，說(shuō)明EGOT可能通過(guò)與相關(guān)蛋白質(zhì)相互作用來(lái)調(diào)控某些基因的表達(dá)。EGOT表達(dá)受抑制可能在乳腺癌的后期發(fā)展中發(fā)揮重要作用，并且EGOT可作為潛在的乳腺癌抑癌因子和預(yù)后標(biāo)志物。

本研究發(fā)現(xiàn)MEG3在不同種族、性別、年齡、分期、分子分型的乳腺癌組織中均顯著低于正常組織的，表明MEG3的低表達(dá)可能與乳腺癌的發(fā)生和發(fā)展相關(guān)。同樣，在食管癌中，MEG3表達(dá)水平也顯著降低，并且可以通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miR-9抑制腫瘤轉(zhuǎn)移[14]。一些學(xué)者通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌細(xì)胞等多種癌細(xì)胞中，MEG3是腫瘤抑制因子，其表達(dá)量很低甚至幾乎不表達(dá)，造成這種情況的原因可能是其啟動(dòng)子區(qū)高甲基化[15]。本研究還發(fā)現(xiàn)當(dāng)MEG3表達(dá)水平較低時(shí)，乳腺癌患者的預(yù)后也較差。通過(guò)功能富集分析，發(fā)現(xiàn)與MEG3表達(dá)相關(guān)的蛋白質(zhì)主要與細(xì)胞基質(zhì)黏附、細(xì)胞外基質(zhì)與受體相互作用等相關(guān)，而這些通路主要影響細(xì)胞間的相互作用、突觸形成、血腦屏障完整性等[16]，說(shuō)明MEG3的異常表達(dá)可能會(huì)對(duì)以上生物過(guò)程產(chǎn)生影響。以上結(jié)果表明，MEG3在乳腺癌中發(fā)揮抑癌作用，其低表達(dá)影響乳腺癌的發(fā)生和發(fā)展，并有望成為判斷乳腺癌患者預(yù)后的生物學(xué)指標(biāo)。

經(jīng)分析，男性乳腺癌患者KCNQ1OT1的表達(dá)水平顯著低于正常組織和女性患者。此外，KCNQ1OT1僅在HER2陽(yáng)性乳腺癌中的表達(dá)水平顯著降低。同樣，KCNQ1OT1表達(dá)水平較低時(shí)，乳腺癌患者的預(yù)后也較差。有研究發(fā)現(xiàn)，KCNQ1OT1可以吸附miR-145，而miR-145抑制CCNE2基因的表達(dá)，所以KCNQ1OT1通過(guò)調(diào)控下游miR-145/CCNE2基因的表達(dá)發(fā)揮作用[17]。通過(guò)功能富集分析，發(fā)現(xiàn)與KCNQ1OT1表達(dá)相關(guān)的蛋白質(zhì)主要與細(xì)胞器和膜包被的內(nèi)腔等細(xì)胞組分方面的功能相關(guān)，表明KCNQ1OT1的異常表達(dá)可能會(huì)影響細(xì)胞的細(xì)胞器。KCNQ1OT1的低表達(dá)可能作為男性乳腺癌患者和HER2陽(yáng)性乳腺癌特異性指標(biāo)和不良預(yù)后指標(biāo)。

圖8 與LncRNA表達(dá)相關(guān)蛋白質(zhì)的GO和KEGG功能富集分析結(jié)果Figure 8 GO and KEGG function enrichment analysis results of proteins related to expression of four lncRNAs

本研究還發(fā)現(xiàn)，NEAT1亞洲患者中的表達(dá)水平顯著低于正常組織，同時(shí)20～60歲患者中表達(dá)水平顯著降低，表明NEAT1是潛在的黃種人乳腺癌患者特異性診斷指標(biāo)，還可能作為年輕乳腺癌患者的生物學(xué)指標(biāo)。此外，Ⅳ期、HER2陽(yáng)性和三陰性等預(yù)后較差的乳腺癌患者中的NEAT1表達(dá)水平較低，生存分析表明NEAT1表達(dá)水平降低的患者預(yù)后較差。但是，有研究發(fā)現(xiàn)三陰性乳腺癌中NEAT1表達(dá)上調(diào)[18]，可能是分析樣本不同的原因，該文獻(xiàn)所使用的為黃種人樣本，而本文所使用的數(shù)據(jù)樣本多為白種人，分析結(jié)果也表明NEAT1在黃種人和白種人之間的表達(dá)水平具有顯著差異。通過(guò)功能富集分析，發(fā)現(xiàn)與NEAT1表達(dá)相關(guān)的蛋白質(zhì)主要與肽運(yùn)輸、DNA幾何變化等生物過(guò)程相關(guān)，表明NEAT1異常表達(dá)可能會(huì)調(diào)控以上過(guò)程，進(jìn)而調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)。以上結(jié)果表明NEAT1在不同乳腺癌患者中具有不同的表達(dá)和功能，可以作為潛在的特異性乳腺癌診斷指標(biāo)和預(yù)后判斷標(biāo)志物。

綜上，四種LncRNA在乳腺癌或部分亞型中表達(dá)下調(diào)，可能是乳腺癌中潛在的抑癌因子，且可能成為判斷乳腺癌患者預(yù)后的生物學(xué)指標(biāo)。本文還通過(guò)功能富集分析方法探討了與四種LncRNA表達(dá)相關(guān)的蛋白質(zhì)的主要功能，但它們影響乳腺癌發(fā)生和發(fā)展的作用機(jī)制還需要進(jìn)行更深入的研究。