張爽 許勇 童琳

摘要：以蝦青素中法夫酵母酶氨基酸序列為研究對(duì)象，利用ProtParam、SignalP、PSORT、ProtScale、SOMPA、PredictProtein、PROSITE、COILS和SWISS-MODEL等在線預(yù)測(cè)工具，對(duì)其理化性質(zhì)、亞細(xì)胞定位、親疏水性、二級(jí)結(jié)構(gòu)、三級(jí)結(jié)構(gòu)等進(jìn)行分析。結(jié)果表明，該轉(zhuǎn)化酶由557個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成，是一種無(wú)信號(hào)肽，具有跨膜結(jié)構(gòu)，定位于細(xì)胞色素氧化酶中的可溶性親水蛋白。α螺旋和無(wú)規(guī)卷曲為主要的二級(jí)結(jié)構(gòu)元件。三級(jí)結(jié)構(gòu)以PDB ID 5vcc.1的B鏈為模板，功能預(yù)測(cè)為細(xì)胞色素P450。生物信息學(xué)手段分析預(yù)測(cè)結(jié)果可靠性較高，為進(jìn)一步研究蝦青素的生物合成調(diào)控機(jī)制提供了理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：蝦青素;法夫酵母;β-胡蘿卜素轉(zhuǎn)化酶;生物信息學(xué)

中圖分類(lèi)號(hào)：S963.73 ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：0439-8114（2020）01-0156-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2020.01.036 ? ? ? ? ? 開(kāi)放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Abstract： The amino acid sequence of the yeast extract of Astaxanthin was used as the research object. The physical and chemical properties and subcellular localization were determined by online prediction tools such as ProtParam， SignalP， PSORT， ProtScale， SOMPA， PredictProtein， PROSITE， COILS and SWISS-MODEL.， pro-hydrophobicity， secondary structure， tertiary structure， etc. were analyzed. The invertase consisted of 557 amino acid residues and was a signal-free peptide， a transmembrane structure， and a soluble hydrophilic protein localized in cytochrome oxidase. The alpha helix and random coil are the primary secondary structural elements. The tertiary structure uses the B-chain of PDB ID 5vcc.1 as a template， and its function is predicted to be cytochrome P450. The bioinformatics method is more reliable in analyzing and predicting the results， which lays a theoretical foundation for further research on the biosynthesis regulation mechanism of astaxanthin.

Key words： astaxanthin; phaffia rhodozyma; β-carotene converting enzyme; bioinformatics

蝦青素（Astaxanthin）是一種抗氧化性極強(qiáng)的天然類(lèi)胡蘿卜素，具有著色、抗腫瘤、增強(qiáng)免疫力等多種生物學(xué)功能，被廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖、醫(yī)藥、保健食品等行業(yè)中[1]。法夫酵母（Phaffia rhodozyma）是一種重要的天然蝦青素資源，其體內(nèi)的β-胡蘿卜素（β-carotene）轉(zhuǎn)化酶（Asy）是目前發(fā)現(xiàn)的惟一一個(gè)直接參與氧化β-胡蘿卜素成為蝦青素的酶[2]。在法夫酵母中，乙酰輔酶A經(jīng)過(guò)甲羥戊酸途徑轉(zhuǎn)變?yōu)楫愇煜┙沽姿幔↖sopentenyl pyrophosphate，IPP），然后通過(guò)異構(gòu)、縮合、脫氫、環(huán)化等步驟合成β-胡蘿卜素，β-胡蘿卜素經(jīng)羥化和酮化作用后形成蝦青素[3]。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

蝦青素法夫酵母β-胡蘿卜素轉(zhuǎn)化酶氨基酸序列下載自NCBI網(wǎng)站，GenBank登錄號(hào)為DQ002007.1。

1.2 ?生物信息學(xué)分析

利用 ProtParam 分析蝦青素法夫酵母β-胡蘿卜素轉(zhuǎn)化酶的理化性質(zhì)，SignalP[4]預(yù)測(cè)信號(hào)肽，PSORT預(yù)測(cè)細(xì)胞亞定位，TMHMM進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)分析，ProtScale預(yù)測(cè)親疏水性[5]，SOMPA預(yù)測(cè)二級(jí)結(jié)構(gòu)[6]，PredictProtein[7]預(yù)測(cè)二硫鍵，PROSITE預(yù)測(cè)功能位點(diǎn)，COILS[8]預(yù)測(cè)卷曲螺旋，SWISS-MODEL[9-11]進(jìn)行同源建模。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?Asy的一級(jí)結(jié)構(gòu)及理化性質(zhì)分析

ProtParam分析結(jié)果顯示，Asy由557個(gè)氨基酸殘基組成（表1），其中比例最高的為L(zhǎng)eu（L），占9.9%;比例最低的為Cys（C），占0.5%。Asy的相對(duì)分子質(zhì)量為62630.88，理論等電點(diǎn)（pI）為5.67，其中帶負(fù)電氨基酸殘基Asp（D）和Glu（E）的總數(shù)為77個(gè)，帶正電氨基酸殘基Arg（R）和Lys（K）的總數(shù)為67個(gè)，半衰期大于30 h，不穩(wěn)定系數(shù)41.77，脂肪族指數(shù)88.98，總平均親水性GRAVY為-0.195，為穩(wěn)定的親水性蛋白質(zhì)。

2.2 ?Asy的信號(hào)肽、亞細(xì)胞定位、跨膜結(jié)構(gòu)域和親疏水性分析

通過(guò)SignalP 4.1 Server分析發(fā)現(xiàn)，Asy的自然分裂位點(diǎn)分值（C-Score）的峰值為0.130 7（第20位），組合分裂位點(diǎn)分值（Y-Score）的峰值為0.284（第20位），組合分裂位點(diǎn)分值（S-Score）的峰值為0.809（第1位），并不存在信號(hào)肽（圖1）。TargetP 1.1 Server-prediction results預(yù)測(cè)Asy在細(xì)胞內(nèi)的定位，mTP為 0.190，SP為0.855，RC為2，說(shuō)明該蛋白主要分布于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。

PSORT 細(xì)胞亞定位預(yù)測(cè)Asy位于細(xì)胞色素氧化酶中。應(yīng)用 TMHMM Server v.2.0對(duì)Asy進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)分析（圖2），發(fā)現(xiàn)該蛋白含有一個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域（TMHs），非跨膜螺旋區(qū)（ExpAA）為22.831 27 ?（>18），預(yù)測(cè)表明該蛋白為跨膜蛋白;蛋白的N端位于膜內(nèi)側(cè)的概率為0.980 63，說(shuō)明該蛋白總體位于膜內(nèi)。通過(guò)ProtScale對(duì)Asy的氨基酸序列親疏水性進(jìn)行在線預(yù)測(cè)，多肽鏈中的第7位L的疏水值為2.733，是疏水性最強(qiáng)的氨基酸，第130位K疏水值為-2.878，是親水性最強(qiáng)的氨基酸。整條肽鏈中親水性氨基酸殘基數(shù)多于疏水性氨基酸殘基（圖3），可以預(yù)測(cè)Asy為可溶性親水蛋白。

2.3 ?Asy的二級(jí)結(jié)構(gòu)分析

利用SOMPA對(duì)Asy的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)其二級(jí)結(jié)構(gòu)中，α螺旋占45.42%（253個(gè)氨基酸殘基），延伸鏈結(jié)構(gòu)占12.03%（67個(gè)氨基酸殘基），β轉(zhuǎn)角占3.59%（20個(gè)氨基酸殘基），無(wú)規(guī)卷曲占38.96%（217個(gè)氨基酸殘基），可以看出α螺旋和無(wú)規(guī)卷曲是Asy二級(jí)結(jié)構(gòu)的主要構(gòu)成原件。

PredictProtein預(yù)測(cè)結(jié)果表明，Asy中不存在二硫鍵;PROSITE蛋白質(zhì)功能位點(diǎn)分析發(fā)現(xiàn)，Asy具有G蛋白偶聯(lián)受體家族1的特征（438-454aa），其氨基酸序列為GTMVMLPLFNINRSKFI。

2.4 ?Asy的卷曲螺旋域分析

如圖4所示，通過(guò)COILS分析，Asy在Window=7、14、21時(shí)，卷曲概率均小于0.5，說(shuō)明Asy不含卷曲螺旋結(jié)構(gòu)。

2.5 ?Asy的三級(jí)結(jié)構(gòu)建模及結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測(cè)

SWISS-MODEL建模以PDB ID 5vcc.1的B鏈為模板，功能預(yù)測(cè)為細(xì)胞色素p450。模型的總體評(píng)價(jià)為0.57，Qmean為-3.68（圖5）。

3 ?討論

β-胡蘿卜素轉(zhuǎn)化酶（Asy）是法夫酵母β-胡蘿卜素到蝦青素轉(zhuǎn)化過(guò)程中發(fā)現(xiàn)的惟一一個(gè)酶，但是目前國(guó)內(nèi)外對(duì)于該酶的研究甚少，其在法夫酵母中的功能、催化機(jī)理及其酶學(xué)性質(zhì)等方面都缺乏深入的研究[12]。從生物信息學(xué)分析的結(jié)果可以看出，Asy整條肽鏈中親水性氨基酸殘基數(shù)多于疏水性氨基酸殘基，并且其二級(jí)結(jié)構(gòu)中富含α螺旋和無(wú)規(guī)卷曲，有助于保持蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定。Asy是穩(wěn)定的親水性蛋白質(zhì)。Asy中不含二硫鍵，這可能是由于其Cys殘基含量低并且在催化功能中發(fā)揮關(guān)鍵作用。蛋白質(zhì)分子內(nèi)或分子間的卷曲螺旋結(jié)構(gòu)主要與分子識(shí)別、細(xì)胞骨架和細(xì)胞運(yùn)動(dòng)等功能相關(guān)，Asy中不含卷曲螺旋結(jié)構(gòu)，也不發(fā)揮上述功能。

研究發(fā)現(xiàn)，Asy是以膜蛋白的形式少量存在于法夫酵母中，Asy同時(shí)具備羥化和酮化的功能。從結(jié)構(gòu)上發(fā)現(xiàn)Asy的438-454aa區(qū)域具有G蛋白耦聯(lián)受體家族1的特征，G蛋白耦聯(lián)受體A類(lèi)為視紫紅質(zhì)樣受體，視紫紅質(zhì)是一種由視黃醛和視蛋白結(jié)合而成的結(jié)合蛋白。通過(guò)生物信息學(xué)手段對(duì)Asy的分析預(yù)測(cè)結(jié)果顯示與其實(shí)際功能有很強(qiáng)的聯(lián)系，證明預(yù)測(cè)結(jié)果的可靠性較高。這對(duì)于研究法夫酵母β-胡蘿卜素到蝦青素的轉(zhuǎn)化過(guò)程提供了新的思路。

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