馮世文 李軍 潘艷

摘要：為調(diào)查廣西不同養(yǎng)殖模式的豬源大腸桿菌耐藥表型差異，為合理使用抗菌藥物防治豬大腸桿菌病和減緩耐藥菌株產(chǎn)生提供參考，采用體外分離培養(yǎng)和體外藥敏試驗(yàn)的方法，分離了廣西不同養(yǎng)殖模式的豬源大腸桿菌，并進(jìn)行耐藥表型檢測和差異性分析。結(jié)果顯示，大規(guī)模養(yǎng)豬場、中小規(guī)模養(yǎng)豬場和散養(yǎng)戶的豬源大腸桿菌對頭孢西丁、頭孢他啶和阿米卡星的敏感率高于70%，而對青霉素G、氨芐西林、阿莫西林、利福平、林可霉素和復(fù)方新諾明的耐藥率均高于90%。大規(guī)模養(yǎng)豬場大腸桿菌對恩諾沙星的耐藥率極顯著低于散養(yǎng)戶（P<0.01），對氧氟沙星、慶大霉素和氟苯尼考的耐藥率顯著低于散養(yǎng)戶（P<0.05）;中小規(guī)模養(yǎng)豬場大腸桿菌對恩諾沙星、強(qiáng)力霉素和氟苯尼考的耐藥性顯著低于散養(yǎng)戶（P<0.05）;散養(yǎng)戶大腸桿菌對環(huán)丙沙星、卡那霉素和壯觀霉素的耐藥率極顯著高于大規(guī)模養(yǎng)豬場和中小規(guī)模養(yǎng)豬場（P<0.01），而對頭孢噻肟的耐藥率極顯著低于大規(guī)模養(yǎng)豬場和中小規(guī)模養(yǎng)豬場（P<0.01）。大規(guī)模養(yǎng)殖場、中小規(guī)模養(yǎng)殖場和散養(yǎng)戶大腸桿菌的多重耐藥指數(shù)（MARI）分別為0.62、0.63和0.68。14～23耐，散養(yǎng)戶（44株）極顯著高于大規(guī)模養(yǎng)豬場（30株）（P<0.01），顯著高于中小規(guī)模養(yǎng)豬場（39株）（P<0.05）。結(jié)果表明，3種養(yǎng)殖模式的豬源大腸桿菌的耐藥情況不同，但均存在嚴(yán)重的耐藥問題，且以多重耐藥為主。

關(guān)鍵詞：養(yǎng)殖模式;豬源致病性大腸桿菌;耐藥性;廣西

中圖分類號：S858.28 ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：0439-8114（2020）01-0114-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2020.01.025 ? ? ? ? ? 開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

Abstract： This study was to investigate the difference of drug resistance phenotype of E. coli isolated from different pigs cultivation modes in guangxi， and to provide a reference for the scientific use of antimicrobial drugs of swine colibacillosis and to slow down the drug resistant strains. E. coli from different pigs cultivation modes in Guangxi was isolated and identified， and the drug-resistant phenotype was tested and analysis. The results showed that， the E.coli isolates from three pigs cultivation modes were highly sensitive to cefoxitin， ceftazidime and amikacin， the sensitive rate up to 70%， while highly resistant to penicillin G， ampicillin， amoxicillin， rifampicin， lincomycin and sulfamethoxazole， the resistance rate up to 90%. The resistance rate of E.coli from large scale pig farms against enrofloxacin was extremely significantly lower than free-range farming （P<0.01）， the resistance rate of E.coli from large scale pig farms against ofloxacin， gentamicin， florfenicol were significantly lower than free-range farmers （P<0.05）. The resistance rate of E. coli from small and medium-sized pig farms against enrofloxacin， doxycycline and florfenicol were significantly lower than free-range farmers （P<0.05）. The resistance rate of E. coli from free-range farmers against ciprofloxacin， kanamycin， spectinomycin were extremely significantly higher than large scale pig farms and small and medium-sized pig farms（P<0.01）， while the resistance rate against cefotaxime was extremely significantly lower than large scale pig farms and small and medium-sized pig farms（P<0.01）. The multiple antibiotics resistance index （MARI） of E. coli from large scale pig farms， small and medium-sized pig farms and free-range farmers was 0.62， 0.63 and 0.68. 14 to 23 resistant E. coli strains accounted in free-range farming， which was extremely significantly higher than large scale pig farms（P<0.01）， and was significantly higher than small and medium-sized pig farms（P<0.05）. The results indicated that the resistance of E. coli from different pigs cultivation mode were different but all very serious and mainly of multi-drug resistance.

Key words： cultivation mode; pig Escherichia coli; drug-resistant; Guangxi

豬大腸桿菌病是由致病性大腸桿菌引起的以腹瀉為主的仔豬腸道傳染病[1]，依據(jù)發(fā)病仔豬的臨床癥狀、病理剖檢變化以及流行病學(xué)，將該病分為仔豬黃痢、仔豬白痢和仔豬水腫病等。仔豬發(fā)病后發(fā)生嚴(yán)重腹瀉，并導(dǎo)致脫水，敗血癥或繼發(fā)其他疾病，仔豬發(fā)育受阻甚至死亡，給養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失[2]。目前仍無有效的疫苗進(jìn)行大腸桿菌病預(yù)防，采用抗菌藥物防治仍是首要選擇。在臨床治療過程中的濫用、無序使用抗菌藥物，特別是在養(yǎng)殖生產(chǎn)中抗菌藥物還作為飼料添加劑來預(yù)防和促進(jìn)動物生長，這些都導(dǎo)致了養(yǎng)殖環(huán)境中抗菌藥物大量殘留和大腸桿菌耐藥菌株的大量產(chǎn)生[3-5]。這些耐藥菌株可以通過畜禽產(chǎn)品途徑傳遞感染人類，給人類的健康安全造成嚴(yán)重威脅。

本試驗(yàn)在廣西地區(qū)大規(guī)模養(yǎng)豬場、中小規(guī)模養(yǎng)殖場和散養(yǎng)戶3種養(yǎng)殖模式采集仔豬腹瀉糞便，分離鑒定大腸桿菌并進(jìn)行體外藥敏試驗(yàn)，分析了不同養(yǎng)殖模式下大腸桿菌的耐藥表型差異，旨在進(jìn)一步豐富廣西地區(qū)豬源致病性大腸桿菌耐藥性流行數(shù)據(jù)，為臨床合理用藥治療豬大腸桿菌病和減緩耐藥菌株產(chǎn)生提供參考。

1 ?材料與方法

1.1 ?樣品采集

2016年于廣西大規(guī)模養(yǎng)豬場、中小規(guī)模養(yǎng)豬場和散養(yǎng)戶分別采集腹瀉仔豬新鮮糞便90份，總共270份。

1.2 ?主要試劑

麥康凱培養(yǎng)基、伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基和MHA培養(yǎng)基購自北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司;微量生化反應(yīng)管和藥敏紙片購自杭州濱和微生物試劑有限公司。

1.3 ?大腸桿菌分離鑒定

無菌取新鮮糞便接種于伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基，挑取黑色金屬光澤單個菌落進(jìn)行純化培養(yǎng)、革蘭氏染色、鏡檢，并進(jìn)行生化試驗(yàn)。

1.4 ?藥敏試驗(yàn)

3種養(yǎng)殖模式分離鑒定的大腸桿菌，分別隨機(jī)選擇60株菌株，采用NCCLS[6]推薦的K-B紙片法，選用青霉素類、頭孢菌素類、氟喹諾酮類、氨基糖苷類等10類共24種抗菌藥物進(jìn)行體外藥敏試驗(yàn)，按照Ф≥20 mm為敏感，15 mm≤Ф<20 mm為中敏，Ф<15 mm為耐藥的判定標(biāo)準(zhǔn)判讀結(jié)果。

1.5 ?數(shù)據(jù)處理分析

計算大腸桿菌分離率（大腸桿菌分離菌株數(shù)/采樣數(shù)×100%），抗菌藥物的敏感率（敏感菌株數(shù)/受試菌株總數(shù)×100%）和耐藥率（耐藥菌株數(shù)/受試菌株總數(shù)×100%）。計算不同養(yǎng)殖模式大腸桿菌的多重耐藥指數(shù)（MARI），計算公式為MARI=A/BC，其中A為細(xì)菌的總抗菌藥物耐藥值，B為檢測的抗菌藥物數(shù)目，C為受試的細(xì)菌菌株數(shù)，0

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?大腸桿菌分離鑒定

依據(jù)分離菌株的培養(yǎng)特性、革蘭氏染色形態(tài)和生化特性，共分離大腸桿菌230株，分離率為85.2%（230/270），大規(guī)模養(yǎng)殖場、中小規(guī)模養(yǎng)殖場、散養(yǎng)戶的分離率分別為88.9%（80/90）、86.7%（78/90）和80.0%（72/90），表明大腸桿菌是引起仔豬腹瀉的主要病原菌。

2.2 ?耐藥表型檢測結(jié)果

1）大規(guī)模養(yǎng)殖場大腸桿菌的耐藥表型。對分離自大規(guī)模養(yǎng)殖場的60株大腸桿菌進(jìn)行體外藥敏試驗(yàn)并統(tǒng)計分析，結(jié)果顯示，菌株對頭孢西丁、頭孢他啶和阿米卡星的敏感率高于78%（圖1）。大規(guī)模養(yǎng)殖場大腸桿菌耐藥率高于90%的抗菌藥物有：青霉素類（98.3%），最高為青霉素G（100%），氨芐西林和阿莫西林分別為98.3%、95.0%;利福霉素類（利福平）為95.0%，林可霉素類（林可霉素）為100%、磺胺類（復(fù)方新諾明）為100%;耐藥率最低的為頭孢菌素類（31.9%），其中頭孢氨芐為63.3%（表1、圖2）。大規(guī)模養(yǎng)殖場大腸桿菌的MARI為0.62，最少對7種抗菌藥物耐藥（1株），最多對22種抗菌藥物耐藥（1株），而對9種和13種抗菌藥物耐藥的菌株數(shù)最多，均為9株（表2）。統(tǒng)計結(jié)果表明，大規(guī)模養(yǎng)殖場大腸桿菌僅對極少數(shù)的抗菌藥物具有高敏感率，對多數(shù)抗菌藥物耐藥且多重耐藥嚴(yán)重。

2）中小規(guī)模養(yǎng)殖場大腸桿菌的耐藥表型。對分離自中小規(guī)模養(yǎng)殖場的60株大腸桿菌進(jìn)行體外藥敏試驗(yàn)并統(tǒng)計分析，結(jié)果顯示，菌株敏感率較高的抗菌藥物有頭孢西?。?1.67%）、頭孢他啶（86.67%）和阿米卡星（70.00%）（圖1）。菌株對青霉素G等6種抗菌藥物耐藥率高于90%，其中青霉素類為95.6%，最高為青霉素G（100%），氨芐西林和阿莫西林均為93.3%;利福霉素類（利福平）為93.3%，林可霉素類（林可霉素）為100%，磺胺類（復(fù)方新諾明）為100%;耐藥率最低的為頭孢菌素類，為32.8%，其中頭孢氨芐和頭孢拉定均為53.3%（表1、圖2）。中小規(guī)模養(yǎng)豬場大腸桿菌的MARI為0.63，最少對5種抗菌藥物耐藥（2株），最多對22種抗菌藥物耐藥（3株）（表2）。統(tǒng)計結(jié)果表明，中小規(guī)模養(yǎng)豬場大腸桿菌僅對極少數(shù)的抗菌藥物具有高敏感率，對多數(shù)抗菌藥物耐藥且具有復(fù)雜的多重耐藥譜。

3）散養(yǎng)戶豬源大腸桿菌的耐藥表型。對分離自散養(yǎng)戶的60株大腸桿菌進(jìn)行體外藥敏試驗(yàn)并統(tǒng)計分析，結(jié)果顯示，敏感率較高的抗菌藥物有頭孢噻肟（88.33%）、頭孢西?。?8.33%）、頭孢他啶（83.33%）和阿米卡星（80.00%）（圖1）。散養(yǎng)戶豬源大腸桿菌除了對頭孢菌素類（27.5%）和大環(huán)內(nèi)酯類（60.0%）的耐藥率較低，對其他抗菌藥物均具有較高的耐藥率，如青霉素類為96.7%，其中氨芐西林和阿莫西林均為93.3%，最高為青霉素G（100%）;氟喹諾酮類為84.6%，其中氧氟沙星為81.7%，環(huán)丙沙星為88.3%，最高為恩諾沙星（90.0%）;氨基糖苷類為68.3%，最高為卡那霉素（100%）;四環(huán)素類（強(qiáng)力霉素）為95.0%，利福霉素類（利福霉素）為96.7%，林可霉素類（林可霉素）為100%，磺胺類（復(fù)方新諾明）為100%，酰胺醇類（氟苯尼考）為86.7%（表1、圖2）。散養(yǎng)戶大腸桿菌的MARI為0.68，最少對9種抗菌藥物耐藥（2株），最多對23種抗菌藥物耐藥（1株），其中對21種抗菌藥物耐藥的菌株數(shù)最多，為11株（表2）。統(tǒng)計結(jié)果表明，散養(yǎng)戶豬源大腸桿菌除了對3種頭孢菌素類和阿米卡星具有較高的敏感性外，對其他20種抗菌藥物均表現(xiàn)出明顯的耐藥性，且多重耐藥情況極其復(fù)雜。

2.3 ?豬源大腸桿菌在不同養(yǎng)殖模式中的耐藥性差異分析

3種養(yǎng)殖模式的豬源大腸桿菌對頭孢西丁、頭孢他啶和阿米卡星的耐藥率均低于20%，差異不顯著（P>0.05）;對青霉素G、氨芐西林、阿莫西林、利福平、林可霉素和復(fù)方新諾明的耐藥率均高于90%，差異不顯著（P>0.05）（表1），表明3種養(yǎng)殖模式的豬源大腸桿菌對抗菌藥物耐藥表型有一定的相似性。

對于諾氟沙星、恩諾沙星、氧氟沙星、氟苯尼考、鏈霉素和慶大霉素6種抗菌藥物，散養(yǎng)戶大腸桿菌的耐藥率最高，中小規(guī)模養(yǎng)殖場大腸桿菌的耐藥率次之，而大規(guī)模養(yǎng)殖場大腸桿菌的耐藥率最低;對于卡那霉素、壯觀霉素和強(qiáng)力霉素，散養(yǎng)戶大腸桿菌的耐藥率高于大規(guī)模養(yǎng)殖場，而大規(guī)模養(yǎng)殖場高于中小規(guī)模養(yǎng)殖場。其中，大規(guī)模養(yǎng)豬場大腸桿菌對恩諾沙星的耐藥率極顯著低于散養(yǎng)戶（P<0.01），而與中小規(guī)模養(yǎng)豬場相比差異不顯著（P>0.05）;其對氧氟沙星、慶大霉素和氟苯尼考的耐藥率顯著低于散養(yǎng)戶（P<0.05），而與中小規(guī)模養(yǎng)豬場相比差異不顯著（P>0.05）;其對鏈霉素的耐藥率顯著低于中小規(guī)模養(yǎng)豬場和散養(yǎng)戶（P<0.05）。中小規(guī)模養(yǎng)豬場大腸桿菌對恩諾沙星、強(qiáng)力霉素和氟苯尼考的耐藥率顯著低于散養(yǎng)戶（P<0.05），其與大規(guī)模養(yǎng)豬場相比差異不顯著（P>0.05）。散養(yǎng)戶大腸桿菌對環(huán)丙沙星、卡那霉素和壯觀霉素的耐藥率極顯著高于大規(guī)模養(yǎng)豬場和中小規(guī)模養(yǎng)豬場（P<0.01）;其對頭孢噻肟的耐藥率極顯著低于大規(guī)模養(yǎng)豬場和中小規(guī)模養(yǎng)豬場（P<0.01）;其對阿米卡星的耐藥率顯著低于中小規(guī)模養(yǎng)殖場（P<0.05），與大規(guī)模養(yǎng)豬場比較差異不顯著（P>0.05）（表1）。統(tǒng)計分析結(jié)果表明，豬源大腸桿菌對抗菌藥物的耐藥情況復(fù)雜，具體到某種抗菌藥物的耐藥率，與飼養(yǎng)模式不完全具有相關(guān)性。

2.4 ?豬源致病性大腸桿菌在不同養(yǎng)殖模式中的多重耐藥性差異比較

按照Magiorakos等[8]的多重耐藥腸桿菌科細(xì)菌定義，耐3類及以上的腸桿菌為多重耐藥菌。統(tǒng)計結(jié)果顯示，大規(guī)模養(yǎng)殖場、中小規(guī)模養(yǎng)殖場和散養(yǎng)戶大腸桿菌的MARI分別為0.62、0.63和0.68，表明3種養(yǎng)殖模式的大腸桿菌均具有嚴(yán)重的耐藥性。其中，大規(guī)模養(yǎng)殖場大腸桿菌的多重耐藥數(shù)為7～22耐，中小規(guī)模養(yǎng)殖場大腸桿菌的多重耐藥數(shù)為5～22耐，散養(yǎng)戶大腸桿菌的多重耐藥數(shù)為9～23耐（表2）。對于9重耐藥和13重耐藥，大規(guī)模養(yǎng)豬場的大腸桿菌菌株數(shù)顯著高于中小規(guī)模養(yǎng)豬場和散養(yǎng)戶（P<0.05），而中小規(guī)模養(yǎng)豬場與散養(yǎng)戶相比差異不顯著;對于21重耐藥，散養(yǎng)戶的大腸桿菌菌株數(shù)顯著高于大規(guī)模養(yǎng)豬場（P<0.05），與中小規(guī)模養(yǎng)豬場比較差異不顯著（P>0.05）。對于14～23重耐藥，散養(yǎng)戶的大腸桿菌菌株數(shù)（44株）極顯著高于大規(guī)模養(yǎng)豬場（30株）（P<0.01），顯著高于中小規(guī)模養(yǎng)豬場（39株）（P<0.05）（表2）。結(jié)果表明，3種養(yǎng)殖模式的大腸桿菌均具有嚴(yán)重的多重耐藥情況，其中散養(yǎng)戶的大腸桿菌以14～23重耐藥為主，情況最為嚴(yán)重。

3 ?討論

在廣西的大規(guī)模養(yǎng)豬場、中小規(guī)模養(yǎng)豬場和散養(yǎng)戶采集仔豬腹瀉糞便用于大腸桿菌分離鑒定，并進(jìn)行體外藥敏試驗(yàn)，調(diào)查了本地區(qū)3種養(yǎng)殖模式下大腸桿菌對10類共24種抗菌藥物的敏感性和耐藥表型并進(jìn)行了耐藥差異性分析。調(diào)查結(jié)果顯示，大規(guī)模養(yǎng)殖場、中小規(guī)模養(yǎng)殖場、散養(yǎng)戶的致病性大腸桿菌分離率分別為88.9%（80/90）、86.7%（78/90）和80.0%（72/90），表明大腸桿菌是引起仔豬腹瀉的主要病原菌。

抗菌藥物敏感性檢測結(jié)果顯示，3種養(yǎng)殖模式的豬源大腸桿菌僅對頭孢菌素類、氨基糖苷類的阿米卡星和大環(huán)內(nèi)酯類的阿奇霉素有較高的敏感率，其中敏感率較高的為頭孢西丁、頭孢他啶和阿米卡星，與魏雅靜等[9]、夏利寧等[10]報道的結(jié)果相似，可能的原因是頭孢菌素類價格貴，臨床用藥較少，此外阿米卡星和阿奇霉素禁用于養(yǎng)殖業(yè)之后，大腸桿菌對其敏感程度可能增強(qiáng)。

3種養(yǎng)殖模式的豬源大腸桿菌均對青霉素類（青霉素、氨芐西林和阿莫西林）、利福霉素類（利福平）、林可霉素類（林可霉素）和磺胺類（復(fù)方新諾明）抗菌藥物具有極高的耐藥率，且高于其他抗菌藥物，這與國內(nèi)近年來的調(diào)查結(jié)果相似，如河南、上海、山東、廣東等地豬源大腸桿菌對氨芐西林、阿莫西林、復(fù)方新諾明耐藥率極高[11-17]。此外，3種養(yǎng)殖模式豬源大腸桿菌對四環(huán)素類的強(qiáng)力霉素、氟喹諾酮類和酰胺醇類的氟苯尼考的耐藥率均高于65%，與以前的調(diào)查結(jié)果[9，18，19]相比，耐藥率顯著升高。調(diào)查發(fā)現(xiàn)，有些抗菌藥物不僅是用于臨床治療，在日常的飼養(yǎng)過程中也添加到飼料中或者直接肌注作為預(yù)防用藥。作為新型的動物專用的抗菌藥物氟苯尼考[20]，1988年研制成功，1999年中國將其批準(zhǔn)為2類新獸藥，盡管上市時間僅有十幾年，但其耐藥率在3種養(yǎng)殖模式下均高于68%，特別是散養(yǎng)戶大腸桿菌的耐藥率高達(dá)86.7%。據(jù)報道，廣東豬源大腸桿菌對氟苯尼考的耐藥率也高達(dá)83.71%[16]，可能與該藥物在臨床上廣泛且不合理使用有關(guān)。

3種養(yǎng)殖模式的大腸桿菌耐藥情況對比分析發(fā)現(xiàn)，對于恩諾沙星、氧氟沙星、環(huán)丙沙星、慶大霉素、卡那霉素、強(qiáng)力霉素、壯觀霉素和氟苯尼考等抗菌藥物，大規(guī)模養(yǎng)豬場、中小規(guī)模養(yǎng)豬場大腸桿菌的耐藥率極顯著低于或顯著低于散養(yǎng)戶。對于諾氟沙星、恩諾沙星、氧氟沙星、氟苯尼考、鏈霉素和慶大霉素6種抗菌藥物，散養(yǎng)戶大腸桿菌的耐藥率最高，中小規(guī)模養(yǎng)殖場次之，而大規(guī)模養(yǎng)殖場最低。

多重耐藥結(jié)果統(tǒng)計分析顯示，大規(guī)模養(yǎng)殖場、中小規(guī)模養(yǎng)殖場和散養(yǎng)戶的MARI分別為0.62、0.63和0.68，表明3種養(yǎng)殖模式的豬源致病性大腸桿菌均具有嚴(yán)重的多重耐藥性，高于孫理云等[17]調(diào)查的集約化豬源菌MARI的0.57，高于Su等[21]調(diào)查華南家畜糞腸桿菌MARI的0.56。統(tǒng)計結(jié)果顯示，對于14～23重耐藥，散養(yǎng)戶的大腸桿菌菌株數(shù)（44株）極顯著高于大規(guī)模養(yǎng)豬場（30株）（P<0.01），顯著高于中小規(guī)模養(yǎng)豬場（39株）（P<0.05），表明散養(yǎng)戶的多重耐藥更為嚴(yán)重。

隨著養(yǎng)豬業(yè)的快速發(fā)展，受市場風(fēng)險和環(huán)保要求影響，散養(yǎng)戶逐步被淘汰，部分中小規(guī)模養(yǎng)殖場遭淘汰，大規(guī)模集約化養(yǎng)殖將成為主要的養(yǎng)殖模式，同時隨著生態(tài)養(yǎng)殖模式在大規(guī)模養(yǎng)殖場得到推廣應(yīng)用，可能降低抗菌藥物的使用種類、使用頻率和使用量，有利于減緩耐藥菌株的產(chǎn)生，大規(guī)模養(yǎng)殖場與中小規(guī)模養(yǎng)殖場的大腸桿菌耐藥情況可能出現(xiàn)顯著性差異。

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