李飛 郭振添 莫海興 丁愛嬌 張拔山

異常凝血酶原-Ⅱ (PIVKA-Ⅱ )是HCC早期篩查較好的腫瘤標(biāo)志物，但對于早期HCC的篩查而言，血清PIVKA-Ⅱ診斷的靈敏度和特異度不盡如人意[1-3]。為了增加HCC早期篩查診斷的靈敏度和特異度，我們引用新的血清標(biāo)志物HBV基因組剪接變異體(Spliced variants of hepatitis B virus genomes, spHBV)，spHBV可反式激活乙肝自身以及宿主細(xì)胞內(nèi)的某些基因(例如乙肝多種病毒啟動子，原癌基因等)，從而加快了慢性乙型肝炎發(fā)展為肝癌的進(jìn)程[4-5]。因此，本次研究旨在對血清spHBV及PIVKA-Ⅱ?qū)CC的診斷預(yù)測價(jià)值進(jìn)行討論，探究血清spHBV及PIVKA-Ⅱ檢測HCC的預(yù)測價(jià)值。

資料與方法

一、實(shí)驗(yàn)對象及標(biāo)本采集

本實(shí)驗(yàn)選取2018年1月1日至2018年12月31日在東莞市人民醫(yī)院接受治療的原發(fā)性肝癌(肝癌組)和慢性乙型肝炎(非肝癌組)患者各46例。納入標(biāo)準(zhǔn)：肝癌組：首先需要是乙肝攜帶者，原發(fā)性肝癌(HCC) 的診斷標(biāo)準(zhǔn)需要均符合《原發(fā)性肝癌診療規(guī)范(2017 版)》，然后再依據(jù)病理學(xué)診斷，納入原發(fā)性肝癌患者。非肝癌組：慢性乙型肝炎的診斷標(biāo)準(zhǔn)需要符合《感染病學(xué)(第九版)》，還需要結(jié)合上腹部CT或MRI的影像結(jié)果確定無肝癌。排除標(biāo)準(zhǔn)：排除其他病毒感染的肝臟疾病，例如甲肝，丙肝等；或由其他病因引起，例如酒精性肝臟疾病、代謝性肝臟疾??；或者由于黃曲霉素引起的肝病，并且也要排除其他系統(tǒng)引起的惡性腫瘤等。因維生素K和華法林等會影響血清中PIVKA-Ⅱ的含量，所以正在使用這2種藥物的研究對象的標(biāo)本予以剔除。本研究獲東莞市人民醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，所有患者均簽署知情同書。取研究對象血清5ml，無抗凝劑真空管收集，-80℃液氮冰箱保存。

二、實(shí)驗(yàn)方法

血清spHBV DNA和wtHBV DNA濃度檢測實(shí)驗(yàn)儀器ABI7600熒光定量PCR分析儀, 血清PIVKA-Ⅱ濃度水平檢測使用儀器雅培I2 000。熒光定量PCR(Real Time Quantitative-PCR, qRT-PCR)檢測血清spHBV和wtHBV基因，按照DNA提取試劑盒(達(dá)安基因公司)說明書提取收集標(biāo)本中的DNA。 spHBV和wtHBV基因應(yīng)用Oligo 7軟件(Molecμlar Biology Insights，Inc.Co，USA)設(shè)計(jì)引物，委托上海Invitrogen英濰捷基公司合成，相關(guān)基因的引物序列見表1。應(yīng)用ABI7 600熒光定量PCR分析儀分別檢測血清標(biāo)本spHBV DNA和wtHBV DNA，PCR擴(kuò)增體系為： 10 μL PCR mastermix(1 mmolL)，上下游引物各0.4 μL(20 μmolL)，2 μL 模板cDNA，7.2 μL 去離子水補(bǔ)足至20 μL。PCR擴(kuò)增先經(jīng)預(yù)變性95℃10 min，然后進(jìn)入50個(gè)擴(kuò)增循環(huán)：95℃變性10 s，55℃退火30 s，72℃延伸60 s，最后72℃延伸10 min。血清spHBV即通過(spHBVDNA/wtHBVDNA)*100%來表示，所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

表1 PCR引物序列

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

本實(shí)驗(yàn)使用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 23.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，Kolmogorov-Smirnov檢驗(yàn)數(shù)據(jù)的正態(tài)分布情況，發(fā)現(xiàn)數(shù)據(jù)均呈偏態(tài)分布。用中位數(shù)(四分位間距)表示各組間spHBV及PIVKA-Ⅱ數(shù)值，計(jì)數(shù)資料使用百分比“%”表示，采用兩獨(dú)立樣本非參數(shù)Mann-Whitney U檢驗(yàn)比較兩組間血清spHBV及PIVKA-Ⅱ水平。并且通過ROC曲線計(jì)算其AUC以進(jìn)行診斷效能評價(jià)，并確定血清spHBV及 PIVKA-Ⅱ的最佳臨界值，同時(shí)計(jì)算血清spHBV及PIVKA-Ⅱ的的診斷指標(biāo)。血清spHBV及PIVKA-Ⅱ的相關(guān)性分析采用Pearson檢驗(yàn)方法進(jìn)行檢測。P<0.05為差異喲統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、肝癌和非肝癌兩組血清spHBV和PIVKA-Ⅱ檢測結(jié)果分析

肝癌和非肝癌兩組血清spHBV及PIVKA-Ⅱ結(jié)果分析：肝癌組兩檢測指標(biāo)的檢測結(jié)果均超過非肝癌組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

表2 血清spHBV及PIVKA-Ⅱ的檢測結(jié)果組間比較M(X25%，X75%)

二、ROC曲線分析及最佳臨界點(diǎn)確定

血清spHBV及PIVKA-Ⅱ單項(xiàng)檢測在肝癌患者診斷中最佳截點(diǎn)分別為11.66%、35.42mAuml。血清spHBV的ROC曲線下面積(AUC)為0.848,而血清PIVKA-Ⅱ的AUCW0.805，但兩者聯(lián)合檢測時(shí)其AUC為0.965遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于單項(xiàng)檢測，如圖1。

圖1 血清spHBV及PIVKA-Ⅱ單項(xiàng)檢測及聯(lián)合檢測的ROC曲線

三、血清spHBV及PIVKA-II對原發(fā)性肝癌的診斷效果評價(jià)

本實(shí)驗(yàn)依據(jù)ROC曲線確定其最佳截點(diǎn)，血清spHBV和PIVKA-II各自的陽性標(biāo)準(zhǔn)分別為spHBV≥11.66%，PIVKA-II ≥35.42mAU mL，血清spHBV的敏感度為74.20%，特異度高達(dá)為93.55%；而血清PIVKA-II的敏感度80.6%，特異度80.6%，見表3。聯(lián)合診斷(1)：是指本實(shí)驗(yàn)檢測指標(biāo)血清spHBV和PIVKA-II濃度水平均超過其最佳截點(diǎn)，即兩項(xiàng)檢測結(jié)果均陽性。聯(lián)合診斷(2)：是指本實(shí)驗(yàn)檢測指標(biāo)血清spHBV和PIVKA-II檢測結(jié)果只要有1項(xiàng)為陽性。

四、血清spHBV及PIVKA-II相關(guān)性分析

本次研究對該實(shí)驗(yàn)的全部樣本，肝癌組標(biāo)本以及非肝癌組標(biāo)本分別作了spHBV和PIVKA-II相關(guān)性分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明不管是本次研究的全部樣本，肝癌組樣本，還是非肝癌組樣本，各指標(biāo)之間均無相關(guān)系(P>0.05)。

討 論

我國大約每年有14萬患者因原發(fā)性肝癌而死亡，慢性乙型肝炎感染大多數(shù)患者最終發(fā)展成為了肝細(xì)胞癌(HCC)，40%的HCC直接歸因于HBV[6]。乙型肝炎病毒相關(guān)原發(fā)性肝癌的危險(xiǎn)因素有多種，例如HBV DNA陽性、年齡(≥40歲)等[7]。HCC的早期篩查診斷主要依賴于影像學(xué)檢查(超聲檢查、CT 檢查、磁共振成像)、肝穿刺和血清檢測項(xiàng)目(如AFP，PIVKA-II等)等。盡管血清AFP是篩查HCC最廣泛的腫瘤標(biāo)志物，但其在急性肝炎患者以及慢性肝炎急性發(fā)作時(shí)亦會有升高。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)血清AFP對HCC診斷的敏感性一般為56%～70%[3,8-11]，其特異性也不高。近年來，大量研究發(fā)現(xiàn)血清PIVKA-Ⅱ?qū)υl(fā)性肝癌具有較好的輔助診斷價(jià)值[1-3,12-14]。本研究中血清PIVKA-II的敏感度和特異度為80.60%和80.60%， 單獨(dú)檢測PIVKA-II用于診斷原發(fā)性肝癌的結(jié)果并不理想。

spHBV目前發(fā)現(xiàn)有14種HBV基因組剪接變異體，而本次設(shè)計(jì)的引物主要用來擴(kuò)增其中3種spHBV，即sp1、sp2、sp4。國外相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道：在慢乙肝感染期間常伴HBV基因發(fā)生剪接變異，其中有超過80%的乙肝患者均會出現(xiàn)這種情況，并且在確診為HCC之前即可觀察到spHBV升高。spHBV隨時(shí)間的推移而發(fā)生顯著變化，在發(fā)展成肝癌之前，spHBV水平每年以0.1%遞增[15]。

本研究對血清spHBV及PIVKA-II對原發(fā)性肝癌的預(yù)測價(jià)值進(jìn)行了探究，本次研究數(shù)據(jù)表明，肝癌組其血清spHBV及PIVKA-II濃度水平顯著高于非肝癌組。當(dāng)血清spHBV的診斷截點(diǎn)設(shè)為11.66%時(shí)，其診斷特異性可以提高到93.55%，其特異度遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過血清PIVKA-II，其敏感性卻不如血清PIVKA-II(80.60%)。如按聯(lián)合診斷(1)的診斷方法診斷HCC，其診斷特異度和陰性預(yù)測值高達(dá)100%；若按聯(lián)合診斷(2)的診斷方法診斷HCC，其診斷的靈敏度和陽性預(yù)測值高達(dá)96.77%及96.00%，其正確指數(shù)高達(dá)74.19%，同兩者單獨(dú)檢測相比較都高。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，spHBV及PIVKA-II單一診斷HCC其漏診率較高，而兩者聯(lián)合診斷AUC高達(dá)0.965，比血清spHBV及PIVKA-II單個(gè)診斷HCC的診斷效能更優(yōu)。兩檢測指標(biāo)進(jìn)行并聯(lián)診斷時(shí)，可明顯提高敏感度及陽性預(yù)測值，更有利于HCC的早期篩查和診斷。由此可見，為了減低HCC的漏診率，減少患者的誤診，推薦使用血清spHBV 聯(lián)合血清AFP進(jìn)行檢測，這樣便可顯著提高早期肝癌患者篩查陽性率，從而減少肝癌患者的漏診，具有更好的預(yù)測價(jià)值。

表3 血清spHBV及PIVKA-II單獨(dú)和聯(lián)合診斷的評價(jià)指標(biāo)(%)

綜上所述，血清spHBV聯(lián)合血清PIVKA-II檢測，可明顯增加肝癌早期篩查的陽性率以及檢出率，顯著提高敏感性，也明顯優(yōu)化了其診斷效能。這可為HCC的早期篩查診斷提供充分的理論依據(jù)。然而本研究選取的樣本只有92例，相對而言標(biāo)本數(shù)量不夠多，并未對所有標(biāo)本觀察調(diào)研很長一段時(shí)間，并未對現(xiàn)今報(bào)道的14種spHBV 進(jìn)行全面檢測，而只是選擇了其中比較常見的三種剪接變異體進(jìn)行檢測，spHBV在HCC中作用機(jī)制及在慢性乙型肝炎的表達(dá)需進(jìn)一步研究。