王 健，解正高，陳 放，朱 俊，杜 偉

目的：通過建立兔角膜堿燒傷模型，比較自體血清與小牛血去蛋白眼用凝膠在兔角膜堿燒傷治療中的效果。

方法：制作兔右眼角膜堿燒傷模型30眼，造模后堿燒傷分度全部為Ⅲ度燒傷，將其隨機分為三組，分別采用生理鹽水、小牛血去蛋白眼用凝膠及自體血清滴眼液4次/d，各組滴阿托品眼用凝膠1次/晚，氧氟沙星眼用凝膠1次/晚，連續(xù)2wk。治療7、14d后觀察角膜新生血管形態(tài)并計算面積；第14d處死各組實驗動物后，摘除雙眼角膜，其中左眼為正常對照，右眼為實驗眼，分別進行常規(guī)組織病理學檢查，角膜組織勻漿內CD45、IL-10、IFN-γ及VEGF濃度測定。

結果：治療7、14d后小牛血去蛋白眼用凝膠組角膜新生血管面積(29.48±2.27、34.19±2.67mm2)與自體血清組(34.19±2.67、33.89±2.74mm2)無差異(P>0.05)。治療14d角膜組織勻漿測定：小牛血去蛋白眼用凝膠組(0.56±0.04ng/mL)和自體血清組(0.54±0.05ng/mL)CD45含量均小于生理鹽水組(1.27±0.07ng/mL)(P<0.05)； 自體血清組(452.49±11.40pg/mL)和小牛血去蛋白眼用凝膠組(332.49±13.67pg/mL)IL-10含量均大于生理鹽水組(111.05±6.95pg/mL)(P<0.05)；小牛血去蛋白眼用凝膠組(23.20±2.89pg/mL)和自體血清組(22.61±2.72pg/mL)IFN-γ含量均小于生理鹽水組(41.77±4.26pg/mL)(P<0.05)；小牛血去蛋白眼用凝膠組(151.14±18.21pg/mL)和自體血清組濃度(149.11±14.75pg/mL)VEGF含量均小于生理鹽水組(391.35±28.59pg/mL)(P<0.05)。

結論：兔角膜堿燒傷后抑制炎癥因子CD45、IFN-γ及VEGF釋放及抑制角膜新生血管形成方面，自體血清與小牛血去蛋白眼用凝膠作用相當；在促進抗炎因子IL-10釋放、抑制炎癥細胞浸潤方面，自體血清作用強，小牛血去蛋白眼用凝膠次之。

0 引言

眼化學傷的發(fā)生約占眼外傷的10%左右，占整個工業(yè)性危害的5%～20%[1]。在各種化學傷中酸燒傷及堿燒傷占據主要地位，其中堿燒傷又因其病理機制復雜，并發(fā)癥較多，預后較差，病程較長成為一類較為棘手的眼科疾病。角膜堿燒傷發(fā)生后，嚴重者留有永久視力損害，更甚者可以發(fā)生角膜潰瘍、角膜穿孔、角膜白斑、干眼、瞼球粘連、并發(fā)性白內障、繼發(fā)青光眼、全眼球炎及眼球萎縮等[2],是臨床常見的致盲原因之一。

堿性物質具有強烈的刺激性和腐蝕性，其對角膜組織的損傷機制為：(1)堿性物質與組織接觸后形成可溶于水的堿-變性蛋白復合物，皂化脂肪組織，從而發(fā)生組織液化性壞死，使堿性物質迅速向四周及深部組織擴散，腐蝕眼內其他組織，嚴重者可以損傷眼底等深部組織[3-4]。(2)堿燒傷后發(fā)生的炎癥反應導致大量多核白細胞向創(chuàng)口移行浸潤，而后釋放大量膠原酶及蛋白酶，進而使得膠原組織溶解，導致角膜潰瘍，嚴重者形成角膜穿孔[5]。(3)中性粒細胞的組織內的浸潤使得自由基產生增加，導致細胞膜的通透性增強，從而使得組織損害進一步加重。此三種機制相互聯(lián)系，相互促進，從而導致角膜損壞的惡性循環(huán)[6-7]，輕者形成角膜云翳，嚴重者發(fā)生角膜白斑、無菌性角膜潰瘍、穿孔、瞼球粘連及繼發(fā)青光眼等，留有永久性視力損害，嚴重者甚至無法保全眼球，導致失明。

目前角膜堿燒傷的藥物治療主要有[2]：局部使用抗生素、散瞳、降眼壓、肝素、膠原酶抑制劑、維生素C，枸櫞酸鈉、免疫抑制劑、表皮生長因子、纖維連接蛋白、基質金屬蛋白酶抑制劑、轉化因子-β、皮質類固醇激素、自體血清等。自體血清自1984年，F(xiàn)ox等[8]首先報道將自體血清用于治療眼表疾病，其后廣泛應用。小牛血去蛋白眼用凝膠其主要成分為20%小牛血去蛋白提取物，基質為卡波姆，含有多種游離氨基酸，低分子肽和寡糖，可以改善線粒體的呼吸功能[9]，增強細胞對葡萄糖及氧的利用，改善微循環(huán)及組織營養(yǎng)，促進ATP合成。小牛血去蛋白提取物眼用凝膠還能阻止堿燒傷組織的繼發(fā)損害，防止損傷范圍擴大與加深，促進角膜損傷的修復[10]。此外，其基質主要為卡波姆，有黏附性，能在局部形成保護膜，對受損角膜起保護作用，同時可以使得藥效更持久[11]。二者在各類原因所致的角膜上皮缺損的治療中應用廣泛，已有大量臨床文獻報道，但二者在角膜堿燒傷中的療效比較鮮有報道，尤其是在動物實驗方面。

本實驗以兔角膜堿燒傷為實驗模型，分別觀察局部使用自體血清、小牛血清去蛋白眼用凝膠及生理鹽水等滴眼后兔角膜堿燒傷的角膜組織病理學改變、角膜新生血管情況及炎癥因子濃度，分析不同組別在角膜堿燒傷治療過程中療效的差異。

1 材料和方法

1.1材料

1.1.1 實驗動物 健康大耳白兔30只(由揚州大學醫(yī)學院實驗動物中心提供)，體質量2.0～2.5kg，雄雌不限，眼部檢查無異常。實驗方案獲院倫理委員會審批通過。30只兔角膜堿燒傷造模并進行燒傷分度全部為Ⅲ度后通過隨機數字表法分為3組，生理鹽水組，小牛血去蛋白眼用凝膠組、自體血清組。每組各10只，每組各只兔分別編號(組號-個號)。

1.1.2主要試劑及儀器 小牛血去蛋白眼用凝膠、阿托品凝膠、氧氟沙星眼膏(沈陽興齊制藥有限公司)，兔自體血清滴眼液(自制)，兔白細胞共同抗原(CD45)、兔γ干擾素(IFN-γ)、兔白細胞介素-10(IL-10)、兔血管內皮細胞生長因子(VEGF)酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒(上?，庬嵣锟萍脊煞萦邢薰?。眼前節(jié)照相機(科林公司)，Image-Pro PLUS 6.0圖像處理軟件(Media Cybernetics 公司)，掃描電鏡(美國FEI公司,XL-30)，酶標儀(瑞士TETCAN公司，TECAN SUNRISE)。

1.2方法

1.2.1建立兔角膜堿燒傷模型 將眼部檢查無異常的大耳白兔30只，每只右眼用0.5%鹽酸丙美卡因滴眼液表面麻醉3次，每次間隔2min。開瞼器開瞼，無菌生理鹽水沖洗結膜囊，以滅菌棉簽擦干結膜囊，將直徑為8mm的滅菌濾紙片浸入1.0mol/L的NaOH溶液中飽和后吸去多余堿液，后將濾紙片置于兔右眼中央角膜表面1min后取出，立即用滅菌生理鹽水連續(xù)沖洗5min，形成邊界清晰的圓形白色燒傷區(qū)域，制作成兔角膜堿燒傷動物模型。依據Hughes分度法為中度堿燒傷[12]。依據我國1982年眼外傷與職業(yè)性眼病協(xié)作小組通過的分度標準[1]為Ⅲ度燒傷。

1.2.2制作兔自體血清滴眼液 于角膜堿燒傷造模分組后將自體血清組各只實驗兔，用離心管分別采集各兔兩耳耳緣靜脈血約10mL，置清潔無菌離心試管中，室溫下靜置2h后以3000r/min離心10min，取上清血清液分別注入有各只實驗兔對應標號的2只無菌滴眼液空瓶中，置于4℃冰箱內避光保存?zhèn)溆谩?wk后棄去先使用的第1支殘液，使用第2支自體血清。

1.2.3給藥方式 各組實驗兔右眼造模后分別以無菌生理鹽水滴眼液、小牛血去蛋白眼用凝膠、自體血清滴眼液滴右眼，每次2滴，每次停留30s以上，4次/d；同時所有實驗兔右眼每晚使用阿托品凝膠及氧氟沙星眼膏涂眼1次，連續(xù)14d。

1.2.4測定角膜新生血管面積 將所有實驗白兔按組及編號分別于造模后7、14d裂隙燈下觀察角膜4個象限最長一支新生血管長度、累及角膜緣鐘點數等情況，按文獻公式進行計算各象限新生血管面積(CRNV)。公式：A=C/12×3.1416[r2-(r-l)2]。C為CRNV累及角膜圓周鐘點數，l為所取血管長度，r為兔角膜半徑6.75mm，總面積等于4個象限之和。

1.2.5測定角膜組織勻漿CD45、IL-10、IFN-γ及VEGF含量 第14d用空氣栓塞法處死各組實驗動物，摘取雙眼，每組左眼作為健眼對照。按編號分別取部分角膜組織，用預冷的0.01mol/L，pH7.4的磷酸鹽緩沖液(PBS)沖凈殘留其上的血液，稱量后將組織剪碎。將剪碎的角膜組織與PBS按 m(角膜組織)∶V(PBS)=1∶9 的比例加入玻璃勻漿器中，于冰上充分研磨。對勻漿液進行超聲破碎。將勻漿液于5000×g離心10min，取上清使用IL-10、CD45、IFN-γ及VEGF的ELISA試劑盒按步驟進行檢測。

1.2.6角膜組織病理學檢查 將摘除的各組及隨機摘取的健眼部分角膜，常規(guī)甲醛固定，石蠟包埋、切片，蘇木精-伊紅染色，100倍顯微鏡下進行組織學觀察。

2 結果

2.1治療7d和14d后三組兔角膜新生血管面積比較 治療7、14d后三組兔角膜新生血管面積比較差異均有統(tǒng)計學意義(P=0.001)。治療7、14d后小牛血去蛋白眼用凝膠組、自體血清組新生血管面積均小于生理鹽水組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；小牛血去蛋白眼用凝膠組與自體血清組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表1、2。

2.2治療14d后三組兔角膜組織勻漿CD45、IL-10、IFN-γ及VEGF含量比較 治療14d后三組兔角膜組織勻漿CD45、IL-10、IFN-γ及VEGF含量比較差異均有統(tǒng)計學意義(P=0.001)。CD45含量小牛血去蛋白眼用凝膠組、自體血清組小于生理鹽水組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；IL-10含量自體血清組大于小牛血去蛋白眼用凝膠組和生理鹽水組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；IFN-γ含量小牛血去蛋白眼用凝膠組、自體血清組小于生理鹽水組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；VEGF含量小牛血去蛋白眼用凝膠組、自體血清組小于生理鹽水組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，表3、4。

2.3治療14d后角膜組織病理學檢查 正常角膜組：角膜上皮完整，基質纖維排列規(guī)則，無水腫及充血，無炎性細胞浸潤；生理鹽水組：角膜上皮斷裂，基質纖維排列不規(guī)則，基質纖維水腫及大量炎性細胞浸潤；小牛血去蛋白眼用凝膠組：角膜上皮完整，基質纖維排列基本規(guī)則，基質纖維輕度水腫及中等量炎性細胞浸潤；自體血清組：角膜上皮完整，基質纖維排列基本規(guī)則，基質纖維輕度水腫及少量炎性細胞浸潤，見圖1。

3 討論

角膜化學燒傷嚴重危害眼組織，臨床上除早期的急診相關處理外，多采取抗炎、抑制免疫反應[13]、角膜移植術、基因治療等手段，治療效果各有優(yōu)缺點[14]，而角膜組織修復也是疾病藥物治療的關鍵環(huán)節(jié)，維持及恢復角膜表層及內皮層的正常細胞代謝是角膜損傷愈合的先決條件?；瘜W致傷物的種類、化學性質、物理性質、穿透組織的能力、濃度、接觸時間和面積，傷后是否接受合理的急救處理等因素影響化學性眼表燒傷的程度和預后。角膜堿燒傷比酸燒傷嚴重，主要因為其病理機制復雜，并發(fā)癥多，預后最差[15]，不僅是眼科的急癥重癥，也是眼科的疑難病癥，是眼部致殘致盲的常見原因之一。

分組治療7d治療14d生理鹽水組46.18±3.6949.24±3.83小牛血去蛋白眼用凝膠組29.48±2.2734.19±2.67自體血清組34.19±2.6733.89±2.74 F56.63141.519P0.0010.001

小牛血清去蛋白眼用凝膠是小牛血清去蛋白提取物的眼用制劑，主要含有無機離子(K+、Cl-、Na+、Ca2+、Mg2+、Fe2+、Zn2+等)及氨基酸、小分子肽、核苷酸、低聚糖、脂類等小分子有機物，其中的小分子活性物質能改善組織細胞對氧和葡萄糖的攝取及利用，還能促進成纖維細胞和內皮細胞的游走和增生，因而能夠促進創(chuàng)傷愈合[16-17]。有研究表明在角膜堿燒傷的藥物治療中，其能阻止角膜繼發(fā)性損害，從而防止組織損傷范圍擴大及加深，促進損傷角膜組織的修復[10]。同時它不含蛋白，較少引起過敏。此外，其基質主要為卡波姆，有黏附性，能在局部形成保護膜，對受損角膜起保護作用，同時可以使得藥效更持久[11]。

自體血清即從患者自己的血液中所提取的血清，去除了血液中的細胞成分和凝血因子，含有氨基酸、維生素、無機鹽、脂質，蛋白質以及大量的活性因子。包含了幾乎所有生理淚液的成分，與淚液的生物力學和生物化學特性也較為相似[18]，pH值和滲透壓也相近，其中纖維連接蛋白，維生素A以及表皮生長因子含量甚至高于正常淚液[18]。1984年，F(xiàn)ox等[8]首先報道將自體血清用于治療眼表疾病。自體血清為自身來源，無過敏反應，機體耐受性較好，患者使用需要采集自身血液。臨床使用過程中需要注意只能采集堿燒傷后1wk內的血清方可使用，因為1wk后機體產生自身抗體，反而不利于組織修復。堿燒傷后角膜中蛋白變性而成為抗原，擴散進入角膜和結膜組織，由于該區(qū)域具有“局部淋巴結”作用而產生免疫應答，同時抗原通過角結膜血管進入血液循環(huán)或淋巴循環(huán)，進而刺激機體免疫器官產生相應抗體[2]。

實驗研究表明：(1)角膜新生血管面積形成方面：正常角膜內無血管是維持角膜組織透明及免疫赦免的必要條件，缺氧、炎癥、感染及外傷等均可誘發(fā)角膜新生血管。角膜堿燒傷易誘導新生血管形成[19-20]。角膜堿燒傷后新生血管為形成因子與抑制因子平衡失調的結果，角膜內調節(jié)因子在角膜新生血管形成中具有重要作用[21],新生血管雖可促進組織修復，但會影響角膜透明度，最終影響視功能[22]。VEGF是目前確定的一種最直接的新生血管形成因子，堿燒傷后角膜組織內大量VEGF表達使血管內皮細胞分裂、增生和遷移，毛細血管基底膜發(fā)生降解，形成新生血管腔。治療7、14d后小牛血去蛋白眼用凝膠組、自體血清組新生血管面積小于生理鹽水組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。小牛血去蛋白眼用凝膠組組、自體血清組角膜新生血管面積相當，顯著小于生理鹽水組，主要是因為二者都含有來源于血液中的大量有效的活性成分，能夠抑制角膜炎癥及減少新生血管形成。(2)角膜組織勻漿CD45、IL-10、IFN-γ及VEGF濃度：治療14d角膜勻漿測定：CD45濃度小牛血去蛋白眼用凝膠組組、自體血清組小于生理鹽水組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；IL-10濃度自體血清組大于小牛血去蛋白眼用凝膠組大于生理鹽水組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；IFN-γ濃度小牛血去蛋白眼用凝膠組、自體血清組小于生理鹽水組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；VEGF濃度小牛血去蛋白眼用凝膠組、自體血清組小于生理鹽水組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。角膜堿燒傷后炎癥反應在角膜組織損傷中起著重要的作用，其中各種炎癥因子又在這一過程中發(fā)揮重要的作用。CD45是位于白細胞表面的白細胞共同抗原(LCA)，高水平表達在除紅細胞和血小板之外的多有造血細胞上。在B細胞和T細胞的不同發(fā)育階段，CD45參與多種免疫功能[23]。IFN-γ具有抗病毒、免疫調節(jié)及抗腫瘤特性，同時還能促成自身免疫。堿燒傷后兩組CD45及IFN-γ濃度小于生理鹽水組，表明自體血清與小牛血去蛋白眼用凝膠組在炎癥因子形成釋放過程中有一定抑制作用。IL-10是一種多細胞源、多功能的細胞因子，調節(jié)細胞的生長與分化，參與炎性反應和免疫反應，是目前公認的炎癥與免疫抑制因子，能夠抑制巨噬細胞釋放炎癥介質。Sotozono等[24]研究發(fā)現(xiàn)，角膜堿燒傷后IL-1,IL-6,IL-10,TNF-α的mRNA表達增高。IL-10濃度自體血清組最高，小牛血去蛋白眼用凝膠組次之，表明自體血清在抑制炎癥過程中能夠促進淋巴細胞釋放抑制炎癥的因子，其效果優(yōu)于小牛血去蛋白眼用凝膠組。VEGF是一種很強的內皮細胞有絲分裂原，可增加血管的通透性，刺激血管內皮細胞的增殖[25]，是目前確定的一種最直接的新生血管形成因子,其過度表達和新生血管形成密切相關[26]。新生血管一方面可以促進角膜修復，但也可以影響角膜透明度。在各組中自體血清組與小牛血去蛋白眼用凝膠組VEGF濃度較低，這與二者角膜新生血管面積有對應關系。有報道提示抑制VEGF的表達可以抑制角膜新生血管形成[27-28]。(3)角膜組織病理學方面：治療14d角膜常規(guī)病理檢查：正常角膜組，角膜上皮完整，基質纖維排列規(guī)則，無水腫及充血，無炎性細胞浸潤；堿燒傷后角膜上皮斷裂，基質纖維排列紊亂，基質纖維水腫及炎性細胞浸潤。治療14d后自體血清組與小牛血去蛋白眼用凝膠組二者比較，上皮基本修復，基質纖維排列較其規(guī)則，炎癥細胞浸潤較少，炎癥細胞較少可使得自由基產生減少，減少膠原溶解，從而減輕組織炎癥反應。

圖1 各組角膜組織病理學檢查圖片(HE×100) A:正常角膜組;B:生理鹽水組;C:小牛血去蛋白眼用凝膠組;D:自體血清組。

表2 治療7d和14d后三組兔角膜新生血管面積組間兩兩比較統(tǒng)計值

組間兩兩比較治療7dtP治療14dtP生理鹽水組vs小牛血去蛋白眼用凝膠組16.70330.00115.2130.001生理鹽水組vs自體血清組17.18830.00115.3780.001小牛血去蛋白眼用凝膠組vs自體血清組0.4850.9620.1650.996

分組CD45(ng/mL)IL-10(pg/mL)IFN-γ(pg/mL)VEGF(pg/mL)生理鹽水組1.27±0.07111.05±6.9541.77±4.26391.35±28.59小牛血去蛋白眼用凝膠組0.56±0.04332.49±13.6723.20±2.89151.14±18.21自體血清組0.54±0.05452.49±11.4022.61±2.72149.11±14.75 F402.0941733.607101.638219.863P0.0010.0010.0010.001

表4 治療14d后三組兔角膜組織勻漿CD45、IL-10、IFN-γ及VEGF含量兩兩比較統(tǒng)計值

組間兩兩比較CD45tPIL-10tPIFN-γtPVEGFtP生理鹽水組vs小牛血去蛋白眼用凝膠組0.71<0.001221.43<0.00118.56<0.001240.21<0.001生理鹽水組vs自體血清組0.73<0.001341.44<0.00119.161<0.001242.24<0.001小牛血去蛋白眼用凝膠組vs自體血清組0.010.576120.00<0.0010.590.7532.030.997

根據文獻報道使用自體血清時應注意時機，應使用傷后1wk內的血清[2]。劉春明[29]實驗證明堿燒傷7d后自體血中可以檢測出抗體，5～6wk達高峰，隨后逐漸下降。在抑制炎癥因子釋放、角膜新生血管形成、抑制炎癥細胞浸潤方面，自體血清與小牛血去蛋白眼用凝膠作用相當。因此，在堿燒傷治療的早期，如果能夠采集自體血清用于治療效果較為理想，其富含多種營養(yǎng)物質，在角膜上皮及基質修復方面有良好效果，不僅能有效降低淚液中炎癥因子濃度[30]，同時還能降低角膜組織中炎癥因子濃度。自體血清采集時注意無菌，以減少污染可能，根據Tsubota等[31]研究在4℃避光保存1mo及-20℃保存3mo時其主要有效成分(EGF，維生素A，TGF-β)濃度無顯著改變。關于自體血清不同濃度的對比研究較少，有報道高濃度可能效果更好[32]。如果沒有條件使用或傷后已逾1wk則優(yōu)先考慮使用小牛血去蛋白眼用凝膠。本研究著重觀察了在角膜堿燒傷后早期自體血清與小牛血去蛋白眼用凝膠二者主要區(qū)別，未能對中晚期療效進行全面比較，有待進一步研究。