蘭 文，陳志鈞，周 璐

目的：觀察MicroRNA-34a對(duì)人晶狀體上皮細(xì)胞系SRA01/04衰老和凋亡的影響及作用機(jī)制。

方法：qRT-PCR檢測(cè)年齡相關(guān)性白內(nèi)障(ARC)晶狀體和透明晶狀體上皮細(xì)胞中MicroRNA-34a表達(dá)水平，采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒將MicroRNA-34a mimics(過表達(dá)組)、MicroRNA-34a inhibitors(抑制組)和空脂質(zhì)體(對(duì)照組)轉(zhuǎn)染至SRA01/04細(xì)胞，qRT-PCR檢測(cè)MicroRNA-34a的表達(dá)量；采用β-半乳糖苷酸(SA-β-gal)染色檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的衰老情況。Annexin V-FITC/PI雙染色流式細(xì)胞儀檢測(cè)MicroRNA-34a對(duì)人晶狀體細(xì)胞系SRA01/04細(xì)胞凋亡的影響；蛋白免疫印跡檢測(cè)Cdc42、Rac1蛋白的表達(dá)。

結(jié)果：透明晶狀體前囊膜組織中MicroRNA-34a的表達(dá)量顯著低于ARC晶狀體前囊膜組織(P<0.05)；MicroRNA-34a過表達(dá)組、對(duì)照組、MicroRNA-34a抑制組SA-β-gal陽性率分別為(87.56±2.34)%、(12.22±2.74)%、(3.45±0.45)%。MicroRNA-34a過表達(dá)組明顯高于對(duì)照組，而MicroRNA-34a抑制組SA-β-gal陽性率明顯低于對(duì)照組(P<0.05)；MicroRNA-34a抑制組、對(duì)照組和MicroRNA-34a過表達(dá)組的細(xì)胞凋亡率分別為(5.87±1.22)%、(12.26±2.14)%、(29.45±3.12)%，MicroRNA-34a抑制組細(xì)胞凋亡率明顯低于對(duì)照組，而MicroRNA-34a過表達(dá)組細(xì)胞凋亡率明顯高于對(duì)照組(P<0.05)；MicroRNA-34a過表達(dá)組中Cdc42和Rac1的表達(dá)明顯高于對(duì)照組(P<0.05)，MicroRNA-34a抑制組中Cdc42和Rac1的表達(dá)明顯低于對(duì)照組(P<0.05)。

結(jié)論：MicroRNA-34a可能通過上調(diào)Cdc42和Rac1促進(jìn)人晶狀體上皮細(xì)胞衰老和凋亡。

0 引言

據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球致盲性眼病中，因白內(nèi)障致盲的患者占比約為50%。隨著世界人口增加，老齡化加劇，年齡相關(guān)性白內(nèi)障(age-related cataract，ARC)發(fā)病人數(shù)逐年上升[1]。目前研究表明，細(xì)胞氧化應(yīng)激是白內(nèi)障產(chǎn)生的首要因素，病理學(xué)研究稱為晶狀體上皮細(xì)胞衰老凋亡[2-3]。微小RNA(MicroRNA)存在于真核生物中，是一類長約18～25個(gè)核苷酸的內(nèi)源性單鏈非編碼RNA，能在轉(zhuǎn)錄水平與特定的靶基因3’非翻譯區(qū)完全或不完全互補(bǔ)配對(duì)，促使靶基因在mRNA水平發(fā)生降解?，F(xiàn)階段研究表明，MicroRNA作為重要的調(diào)節(jié)因子，參與多種人類疾病的發(fā)展[4]，在疾病的診斷和治療中發(fā)揮積極作用[5]。近年來MicroRNA在眼科疾病的研究已經(jīng)開展，MicroRNA在哺乳動(dòng)物眼部表達(dá)豐富且分布廣泛，高表達(dá)于角膜上皮細(xì)胞、睫狀體、晶狀體及視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞。其中ARC中表達(dá)最多的是MicroRNA-34a。文獻(xiàn)報(bào)道稱Rho蛋白家族(Cdc42、Rac1等)作為Ras超家族中小分子G蛋白的成員之一，在晶狀體上皮細(xì)胞和纖維細(xì)胞中表達(dá)，參與到細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[6]，激活其下游靶分子Rho激酶從而參與多種生物效應(yīng)，譬如維持細(xì)胞微觀形態(tài)功能的穩(wěn)定、增殖與遷移[7]、基因轉(zhuǎn)錄、分化[8-9]、增殖凋亡等[10]。Rac1和Cdc42又是Rho家族蛋白重要成員，有文獻(xiàn)指出Rac1和Cdc42能夠促進(jìn)晶狀體上皮細(xì)胞遷移[11]，但對(duì)細(xì)胞的衰老和凋亡還沒有研究。本文通過觀察ARC晶狀體和透明晶狀體中MicroRNA-34a的表達(dá)，探討其對(duì)晶狀體細(xì)胞衰老和凋亡的研究，以期為白內(nèi)障的防治提供新的方法。

1 材料和方法

1.1材料

1.1.1組織標(biāo)本和細(xì)胞 透明晶狀體前囊膜40例，取自南京醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院眼庫，來源于眼庫角膜移植供體；ARC晶狀體前囊膜40例，取自南京醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院眼科常規(guī)白內(nèi)障手術(shù)術(shù)中。透明晶狀體前囊膜患者的平均年齡為52.34±5.21歲，ARC晶狀體前囊膜患者的平均年齡為52.35±5.19歲?；颊呒捌浼覍俸炇鹬橥鈺＞铙w上皮細(xì)胞SRA01/04采購自中科院上海細(xì)胞生物研究所。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)展開。

1.1.2主要儀器和試劑 胰蛋白酶、qRT-PCR檢測(cè)試劑盒購自碧云天生物技術(shù)有限公司；RPIM1640細(xì)胞培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；Trizol總RNA提取試劑盒購自廣東銳博生物科技技術(shù)股份有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國Sigma；MicroRNA-34a inhibitors、MicroRNA-34a mimics和空脂質(zhì)體(貨號(hào)B05009)由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司代為合成；Lipofectamine 2000購自美國Invitrogen公司；青、鏈霉素購自華北制藥有限公司、SYBR Premix Extaq system日本Takara公司；細(xì)胞培養(yǎng)箱采購自上海三騰儀器有限公司。兔抗人Cdc42和兔抗人Rac1(WB)購自美國abcam公司、二抗(IHC)、GAPDH鼠抗購自Fermentas公司。實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀購自美國Thermo公司、細(xì)胞培養(yǎng)箱購自SANYO、生物安全柜購自haier；高速離心機(jī)購自Thermo；Ti-U/Ti-s倒置熒光顯微鏡購自Nikon。

1.2方法

1.2.1 qRT-PCR檢測(cè)MicroRNA-34a基因的表達(dá) 取透明人晶狀體前囊膜組織和ARC人晶狀體前囊膜組織，Trizol液與組織處理液混合作用10min，以1.2×104r/min離心10min，去除上層清液，加入Trizol與氯仿震蕩混勻，以1.2×104r/min離心20min，加入異丙醇，用移液器吹打均勻，以1.2×104r/min離心10min后，棄去上層清液，留下層絮狀沉淀，加入Trizol與乙醇的混合液，以1.2×104r/min離心10min后，棄上清液，提取的RNA用DEPC水溶解，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒轉(zhuǎn)錄cDNA，按照SYBR方法進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR。反應(yīng)條件為94℃ 30s，1 cycle；95℃ 5s，60℃ 30s，40 cycles；95℃ 5s，60℃ 1min，95℃，1cycle。以U6作為內(nèi)參，上游引物為5’-CTC GCT TCG GCA GCA CA-3’，下游引物為5’-AAC GCT TCA CGA ATT TGC GT-3’。引物MicroRNA-34a上游引物為5’-CGG CGT GGC AGT GTC TTA G-3’，下游引物為5’-GTC GTA TCC AGT GCA GGG TCC GAG GTA TTC GCA CTG GAT ACG ACA CAA CC-3’，結(jié)果采用2-△△Ct法計(jì)算。

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng) 液氮中取出人晶狀體細(xì)胞系SRA01/04，置于37℃水浴溶解，加入含10%胎牛血清(FBS)的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)48h，然后離心去上清，加入DMEM培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞，接種于培養(yǎng)瓶中。置于二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件37℃，5% CO2濃度。傳代一次，待細(xì)胞處于對(duì)數(shù)期用于后續(xù)研究。

1.2.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染 調(diào)整人晶狀體細(xì)胞系SRA01/04細(xì)胞濃度為1×106個(gè)/mL，取2mL接種于6孔板中，培養(yǎng)過夜，采用Lipofectamine2000將濃度均為50nmol/L的MicroRNA-34a mimics、MicroRNA-34a inhibitors和空脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染至細(xì)胞。其中轉(zhuǎn)染MicroRNA-34a mimics的細(xì)胞作為MicroRNA-34a過表達(dá)組，轉(zhuǎn)染MicroRNA-34a inhibitors的細(xì)胞作為MicroRNA-34a抑制組，轉(zhuǎn)染空脂質(zhì)體的細(xì)胞作為對(duì)照組。qRT-PCR檢測(cè)MicroRNA-34a的表達(dá)量。

1.2.4采用β-半乳糖苷酸(SA-β-gal)染色檢測(cè)細(xì)胞的衰老情況 將各組細(xì)胞接種于6孔板培養(yǎng)24h后，離心去除培養(yǎng)基，然后采用PBS洗滌，離心去上清，加入1mL β-半乳糖苷酶染色固定液，室溫固定15min，PBS洗滌3次，離心，去上清加入1mL染色工作液，37℃孵育過夜，光學(xué)顯微鏡下觀察染色結(jié)果并進(jìn)行衰老細(xì)胞計(jì)數(shù)，SA-β-gal陽性細(xì)胞(衰老細(xì)胞)中可見藍(lán)色沉淀物，分別統(tǒng)計(jì)3個(gè)不同視野中的細(xì)胞總數(shù)和SA-β-gal陽性細(xì)胞數(shù)，SA-β-gal陽性細(xì)胞百分比(%)=SA-β-gal陽性細(xì)胞個(gè)數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.2.5 MicroRNA-34a對(duì)人晶狀體細(xì)胞系SRA01/04細(xì)胞凋亡的影響 Annexin V-FITC/PI雙染色流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡，收集各組細(xì)胞，PBS洗滌，離心去除上清，然后加入300μL的結(jié)合緩沖液，混勻，加入5μL Annexin V-FITC 和5μL PI，避光孵育30min，然后上機(jī)檢測(cè)，分析細(xì)胞早期和晚期凋亡率。

1.2.6蛋白免疫印跡檢測(cè)Cdc42、Rac1蛋白的表達(dá) 收集各組細(xì)胞，加細(xì)胞裂解液，冰上裂解30min，超聲裂解30s，10000r/min，4℃離心10min，收集上清，BCA檢測(cè)蛋白濃度，待測(cè)樣品和Loading buffer混合，然后加入至制備好的SDS-PAGE凝膠上樣孔中，進(jìn)行分離，結(jié)束后取出凝膠，轉(zhuǎn)膜，封閉，加入兔抗人Cdc42(兔抗人Rac1)，4℃過夜，加入辣根過氧化物標(biāo)記的羊抗兔IgG，37℃孵育2h，ECL顯影，采用自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)采集圖像，以GAPDH作為內(nèi)參進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 MicroRNA-34a在透明晶狀體前囊膜組織和ARC晶狀體前囊膜組織中的表達(dá) qRT-PCR結(jié)果顯示透明晶狀體前囊膜組織中MicroRNA-34a的表達(dá)量顯著低于ARC晶狀體前囊膜組織，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖1。

2.2 MicroRNA-34a轉(zhuǎn)染晶狀體細(xì)胞系SRA01/04的表達(dá) qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示MicroRNA-34a過表達(dá)組中MicroRNA-34a的表達(dá)明顯高于對(duì)照組(P<0.05)，MicroRNA-34a抑制組中MicroRNA-34a的表達(dá)明顯低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖2，提示成功構(gòu)建MicroRNA-34a過表達(dá)/抑制細(xì)胞株。

2.3 MicroRNA-34a對(duì)人晶狀體細(xì)胞系SRA01/04細(xì)胞衰老的影響 光學(xué)顯微鏡下觀察，SA-β-gal陽性細(xì)胞中可見藍(lán)色沉淀物。MicroRNA-34a過表達(dá)組呈強(qiáng)陽性染色，對(duì)照組、MicroRNA-34a抑制組著染陰性。MicroRNA-34a過表達(dá)組、對(duì)照組、MicroRNA-34a抑制組SA-β-gal陽性率分別為(87.56±2.34)%、(12.22±2.74)%、(3.45±0.45)%。MicroRNA-34a過表達(dá)組明顯高于對(duì)照組，而MicroRNA-34a抑制組SA-β-gal陽性率明顯低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示過表達(dá)MicroRNA-34a可促進(jìn)SRA01/04細(xì)胞衰老，見圖3。

2.4 MicroRNA-34a對(duì)人晶狀體細(xì)胞系SRA01/04細(xì)胞凋亡的影響 MicroRNA-34a抑制組、對(duì)照組和MicroRNA-34a過表達(dá)組的細(xì)胞凋亡率分別為(5.87±1.22)%、(12.26±2.14)%和(29.45±3.12)%，MicroRNA-34a抑制組細(xì)胞凋亡率明顯低于對(duì)照組，而MicroRNA-34a過表達(dá)組細(xì)胞凋亡率明顯高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖4。

2.5 MicroRNA-34a對(duì)Cdc42和Rac1蛋白的影響 Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，MicroRNA-34a過表達(dá)組中Cdc42和Rac1的表達(dá)明顯高于對(duì)照組，MicroRNA-34a抑制組中Cdc42和Rac1的表達(dá)明顯低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖5。

3 討論

隨著當(dāng)今社會(huì)老齡化發(fā)展，有報(bào)告指出2020年我國50歲以上患白內(nèi)障的人群將達(dá)到總?cè)藬?shù)的1/4，白內(nèi)障手術(shù)需求量逐年增加，給國家和個(gè)人帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。因此研究ARC的發(fā)病機(jī)制，尋找非手術(shù)的治療方法，具有重大意義。

圖1 MicroRNA-34a在透明晶狀體前囊膜組織和ARC晶狀體前囊膜組織的表達(dá)aP<0.05vs透明晶狀體前囊膜組織。

圖2 RT-PCR檢測(cè)MicroRNA-34a在人晶狀體細(xì)胞系SRA01/04中的表達(dá)aP<0.05vs對(duì)照組。

文獻(xiàn)報(bào)道[12]稱ARC是晶狀體衰老的表現(xiàn)，而氧化損傷是ARC發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。隨著年齡增加，細(xì)胞機(jī)能減退，細(xì)胞代謝產(chǎn)物和外部因子均不斷形成自由基，衰老的晶狀體細(xì)胞酶活性下降，抗氧化能力減弱，多余的自由基無法被清除，出現(xiàn)積累，就會(huì)對(duì)晶狀體產(chǎn)生氧化損傷，進(jìn)而攻擊細(xì)胞膜，導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化，造成蛋白質(zhì)和DNA損傷，導(dǎo)致晶狀體混濁[12-13]。表觀遺傳學(xué)調(diào)控基因表達(dá)的機(jī)制包括DNA甲基化、組蛋白修飾及微小RNA(MicroRNA)。其中MicroRNA的出現(xiàn)，為研究開拓了新思路。MicroRNA在哺乳動(dòng)物中保持高度同源性，可與靶基因序列3’非編碼區(qū)結(jié)合，通過調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長發(fā)育、分化、增殖、凋亡和衰老等。文獻(xiàn)報(bào)道稱在過氧化氫誘導(dǎo)的早衰細(xì)胞以及自然復(fù)制性衰老細(xì)胞中MicroRNA-34a表達(dá)均會(huì)出現(xiàn)異常升高[14-15]。

文獻(xiàn)報(bào)道稱患者晶狀體混濁程度與MicroRNA-34a表達(dá)呈明顯的正相關(guān)關(guān)系，提示MicroRNA-34a在ARC發(fā)生發(fā)展過程中起著關(guān)鍵作用[16]。本研究qRT-PCR結(jié)果顯示透明晶狀體前囊膜組織中MicroRNA-34a的表達(dá)量顯著低于ARC晶狀體前囊膜組織，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。為了進(jìn)一步觀察MicroRNA-34a在ARC中的作用，本研究又以SRA01/04細(xì)胞株為研究對(duì)象，采用細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)構(gòu)建MicroRNA-34a過表達(dá)抑制細(xì)胞株，然后觀察MicroRNA-34a對(duì)SRA01/04細(xì)胞的衰老和凋亡的影響。文獻(xiàn)報(bào)道[17]稱衰老的細(xì)胞中β-半乳糖苷酶的表達(dá)量會(huì)極具升高，因此SA-β-gal染色陽性常常作為細(xì)胞衰老的生物學(xué)標(biāo)志。本研究通過SA-β-gal染色檢測(cè)MicroRNA-34a對(duì)SRA01/04細(xì)胞衰老情況的影響，結(jié)果顯示MicroRNA-34a過表達(dá)組呈強(qiáng)陽性染色，空脂質(zhì)體組、MicroRNA-34a抑制組著染陰性，陽性率分別為(87.56±2.34)%、(12.22±2.74)%、(3.45±0.45)%，MicroRNA-34a過表達(dá)組明顯高于對(duì)照組和MicroRNA-34a抑制組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。進(jìn)一步采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)MicroRNA-34a對(duì)SRA01/04細(xì)胞凋亡的影響，結(jié)果顯示MicroRNA-34a抑制組、對(duì)照組和MicroRNA-34a過表達(dá)組的細(xì)胞凋亡率分別為(5.87±1.22)%、(12.26±2.14)%和(29.45±3.12)%，MicroRNA-34a抑制組細(xì)胞凋亡率明顯低于對(duì)照組，而MicroRNA-34a過表達(dá)組細(xì)胞凋亡率明顯高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示過表達(dá)MicroRNA-34a可促進(jìn)SRA01/04細(xì)胞衰老和凋亡。

圖3 MicroRNA-34a對(duì)人晶狀體細(xì)胞系SRA01/04細(xì)胞衰老的影響(×200) A：MicroRNA-34a抑制組；B：對(duì)照組；C：MicroRNA-34a過表達(dá)組;D：三組SA-β-gal陽性率比較，aP<0.05vs對(duì)照組。

圖4 MicroRNA-34a對(duì)人晶狀體細(xì)胞系SRA01/04細(xì)胞凋亡的影響 A：MicroRNA-34a抑制組；B：對(duì)照組；C：MicroRNA-34a過表達(dá)組;D：三組細(xì)胞凋亡率比較，aP<0.05vs對(duì)照組。

圖5 MicroRNA-34a對(duì)Cdc42和Rac1蛋白的影響 A：三組Western blot檢測(cè)結(jié)果；B：三組Cdc42的表達(dá)比較；C：三組Rac1的表達(dá)比較。aP<0.05vs對(duì)照組。

Rho蛋白家族能夠參與并調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、基因表達(dá)及細(xì)胞骨架重組，是參與細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要蛋白，能夠改變和影響細(xì)胞生物學(xué)功能。其中Cdc42蛋白作為Rho家族蛋白重要成員之一，主要參與調(diào)解細(xì)胞骨架中肌動(dòng)蛋白重排、調(diào)控蛋白激酶，啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)外信號(hào)等來影響細(xì)胞增殖、侵襲、分化和轉(zhuǎn)移等[18]。Rac1蛋白作為信號(hào)傳導(dǎo)通路關(guān)鍵因子，文獻(xiàn)報(bào)道稱[19]其是信號(hào)傳導(dǎo)通路中的分子開關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，MicroRNA-34a過表達(dá)可促進(jìn)晶狀體上皮細(xì)胞凋亡。本研究Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示MicroRNA-34a過表達(dá)組中Cdc42和Rac1的表達(dá)明顯高于對(duì)照組，MicroRNA-34a抑制組中Cdc42和Rac1的表達(dá)明顯低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示MicroRNA-34a能通過調(diào)節(jié)Cdc42、Rac1基因表達(dá)來促進(jìn)人晶狀體上皮細(xì)胞SRA01/04的衰老和凋亡。

綜上所述，MicroRNA-34a在ARC人晶狀體上皮細(xì)胞中高表達(dá)，其可能通過調(diào)節(jié)Cdc42、Rac1基因表達(dá)，調(diào)控人晶狀體上皮細(xì)胞衰老和凋亡這一生理過程，從而在白內(nèi)障的發(fā)病機(jī)制中行使重要的功能，成為白內(nèi)障診治的潛在新途徑。