楊金鳳 張 婷 李 潔

（河北民族師范學(xué)院 生物與食品科學(xué)系，河北 承德 067000）

塊菌（Truffles）是一類(lèi)呈塊狀的地下真菌的通稱(chēng)，包括真塊菌、假塊菌和豆塊菌[1]63-67三個(gè)不同的科屬。常生長(zhǎng)于鈣質(zhì)的土壤中，多與針葉樹(shù)和闊葉樹(shù)植物的根系共生，形成外生菌根[2]。我國(guó)的塊菌主要分布于云南、四川、新疆和西藏等地，此外在河北、山西、湖南、吉林、甘肅、遼寧、北京、福建、湖北和臺(tái)灣等地均有少量分布[3]1560-1565。塊菌大多數(shù)是以宏觀(guān)特征如子實(shí)體和子囊孢子的形態(tài)特征來(lái)進(jìn)行區(qū)分，但在區(qū)分兩個(gè)形態(tài)比較相似或親緣關(guān)系較近的種時(shí)會(huì)遇到難題[4]6-10，而分子生物學(xué)的應(yīng)用克服了傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)觀(guān)察的缺點(diǎn)，為生物種屬的確定提供了可靠的證據(jù)。

塊菌又被稱(chēng)為“豬拱菌”，其營(yíng)養(yǎng)豐富，氣味芬芳。富含多種氨基酸、蛋白質(zhì)以及不飽和脂肪酸等生理活性成分及多樣性的微量元素，具有抗氧化、抗突變、抑菌、保肝、抗癌和抗炎等廣泛的生物活性[5]465-472，且抗氧化能力比其它食用菌高[6]2567-2581。本研究對(duì)河北野生白塊菌和云南黑塊菌抗氧化能力進(jìn)行初步研究，以期為河北塊菌的開(kāi)發(fā)和利用提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 試驗(yàn)材料

河北白塊菌，采自河北省承德市雙橋區(qū)普寧寺后山；云南黑塊菌，采自云南怒江自治州貢山縣丙中洛鎮(zhèn)。

2 試驗(yàn)方法

2.1 塊菌形態(tài)觀(guān)察

2．1．1 外部形態(tài)觀(guān)察

肉眼觀(guān)察河北白塊菌子實(shí)體的形狀、大小、顏色，子囊果表面有無(wú)疣突或被絨毛或微絨毛等結(jié)構(gòu)。

2．1．2 解剖結(jié)構(gòu)觀(guān)察

橫切面觀(guān)察：菌脈的排列情況、顏色，產(chǎn)孢組織的顏色、質(zhì)地等；

顯微結(jié)構(gòu)觀(guān)察：采用徒手切片法制成塊菌子實(shí)體臨時(shí)裝片，觀(guān)察孢子囊的大小、形狀、顏色以及孢子的數(shù)目、大小、形狀和表面紋飾等。

2.2 塊菌分子生物學(xué)水平鑒定

采用Ezup柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒提取河北白塊菌基因組DNA，以通用引物

18S1(CCAACCTGGTTGATCCTGCCAGTA)18S2(CCTTGTTACGACTTCACCTTCCTCT)進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增體系模板1μL，2×Master Mixture 12.5μL，18S1/18S2引物各1μL，加ddH2O補(bǔ)足至25μL。擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性4 min，94℃變性1min，56℃退火1min，72℃延伸1min，35 個(gè)循環(huán)，72℃平展10 min，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，并將產(chǎn)物送至上海生工進(jìn)行雙向測(cè)序。

2.3 塊菌提取物的制備

參照郭坦等[5，7-9]塊菌提取物的制備方法稍作修改。準(zhǔn)確稱(chēng)取干燥的塊菌菌粉20．000g加入800mL55%的乙醇，浸泡48h后超聲提取30min，8000rpm離心5min，取上清液旋蒸至無(wú)醇味，加入等體積的石油醚萃取，靜置分層，將各層得到的粗提物濃縮，定容至20mL，4℃避光保存，備用。

2.4 塊菌提取物抗氧化活性測(cè)定

2．4．1 總抗氧化能力的測(cè)定

總抗氧化能力的測(cè)定參照延莎等[10-13]的方法稍作修改。取0．2mL待測(cè)樣品加入0．6mL的28mmol/L磷酸鈉溶液、4mmol/L鉬酸銨溶液和0．6mol/L硫酸溶液，混勻后于95℃水浴90min，以溶劑作為空白對(duì)照，冷卻后在695nm處測(cè)定吸光度值，并以VC標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)定總抗氧化能力標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，計(jì)算塊菌提取物相對(duì)于VC的濃度。

2．4．2 DPPH自由基清除能力的測(cè)定

DPPH自由基清除能力的測(cè)定參照張婷等[10，14]方法適當(dāng)修改。取待測(cè)樣品500μL，加入DPPH自由基溶液6mL，并加入無(wú)水乙醇補(bǔ)足至10mL，以溶劑作對(duì)照，在517nm下測(cè)量各樣品吸光度值A(chǔ)樣品，計(jì)算各樣品DPPH自由基清除率：

DPPH自由基清除率（%）=[(A對(duì)照-A樣品)/A對(duì)照]×100%

2．4．3 羥自由基清除能力的測(cè)定

羥自由基清除能力的測(cè)定參照張新國(guó)等[15-18]的方法。取1．0mL各待測(cè)提取物，依次加入1．0mL9．0mmol/L硫酸亞鐵、1．0mL9．0mmol/L水楊酸-乙醇溶液和1．0mL8．8mmol/LH2O2，迅速混勻，37℃恒溫30min，于510nm波長(zhǎng)下測(cè)定其吸光度值A(chǔ)x，以VC作為陽(yáng)性對(duì)照，以溶劑作為空白對(duì)照A0；以蒸餾水代替9．0mmol/L的水楊酸-乙醇溶液作為樣品對(duì)照Ab。計(jì)算羥自由基清除率：

羥自由基清除率（%）=[A0-(Ax-Ab)]/A0×100%

3 結(jié)果與分析

3.1 生長(zhǎng)環(huán)境與形態(tài)學(xué)特征

河北白塊菌生長(zhǎng)于土壤干燥且通氣良好的山坡地，其周?chē)L(zhǎng)有各種草本植物、灌木以及喬木，河北白塊菌在土壤下2～30厘米處與植物的根共生（圖1）。子囊果地下生，整體形狀近似球形，顏色為白黃色至黃褐色，子囊果外覆蓋有白色菌絲，表面凹凸不平有內(nèi)陷的小孔，表面光滑或稍粗糙，無(wú)疣突，成熟的塊菌表面有龜裂（圖2）。

圖1 河北白塊菌生長(zhǎng)環(huán)境

圖2 塊菌外部形態(tài)結(jié)構(gòu)

如圖3-a所示塊菌子實(shí)體產(chǎn)孢組織黃褐色，成熟后形成空腔向內(nèi)凹陷，菌脈白色，呈大理石紋理樣，菌脈貫穿整個(gè)子囊果。由3-b可以看出產(chǎn)孢細(xì)胞呈不規(guī)則狀散亂分布，子囊在產(chǎn)孢組織內(nèi)自由排列，3-c、d顯示子囊呈球形至橢圓形或圓柱狀至棒狀，無(wú)色透明，每個(gè)子囊內(nèi)包含有8個(gè)子囊孢子，子囊孢子呈球狀，黃色至黃褐色，孢子表面具有明顯的鈍刺；顯微鏡下能明顯看到其菌脈紋理結(jié)構(gòu)。

3.2 塊菌分子生物學(xué)鑒定

瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小約為1500 bp（圖4）。M為DL2000，1為陰對(duì)照，2、3為河北白塊菌。

圖4 PCR電泳圖

將測(cè)序結(jié)果進(jìn)行序列拼接后與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)，與編號(hào)為AJ305045．1的地菇狀馬蒂奧洛塊菌18SrDNA區(qū)段的DNA序列同源性達(dá)100%，兩者對(duì)比的Max score值為1144，堿基覆蓋率達(dá)96%。結(jié)合形態(tài)學(xué)特征，確定該河北白塊菌屬于地菇狀馬蒂奧洛塊菌（Mattirolomyces terfezioides）。

3.3 塊菌提取物抗氧化活性分析

3．3．1 總抗氧化能力

按照2．4．1測(cè)定總抗氧化能力的方法，繪制VC標(biāo)準(zhǔn)品總抗氧化能力標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，結(jié)果如圖5。

圖5 VC總抗氧化能力標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

測(cè)定各層塊菌提取物的總抗氧化能力，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程計(jì)算出各層提取物相對(duì)于VC標(biāo)準(zhǔn)品的濃度(mg/mL)，結(jié)果如表1所示。

表1 塊菌提取物總抗氧化能力

由表1可知，河北白塊菌水層提取物的總抗氧化活性最強(qiáng)，其次是乙醇層提取物，石油醚層提取物的總抗氧化能力最低。每毫升1g河北白塊菌的水層提取物的總抗氧化能力相當(dāng)于14．4225mg/mL的VC標(biāo)準(zhǔn)品，是云南黑塊菌水層提取物總抗氧化能力的2．29倍；河北白塊菌乙醇層提取物的總抗氧化能力是云南黑塊菌的2．31倍。

3．3．2 DPPH自由基清除能力

將水層提取物稀釋10倍，乙醇層和石油醚層提取物均未稀釋?zhuān)瑴y(cè)定各層塊菌提取物的DPPH自由基清除率，結(jié)果如表2所示。含0.1g塊菌的提取物；乙醇層和石油醚層提取物未稀釋?zhuān)瑸槊亢辽?g塊菌的提取物。

表2 DPPH自由基清除能力

由表2可知，河北白塊菌和云南黑塊菌提取物都有一定的DPPH自由基清除能力，其中河北白塊菌水層提取物的DPPH清除能力最高，達(dá)51．90%，顯著高于黑塊菌水層提取物；石油醚層提取物的最低；河北白塊菌乙醇層提取物DPPH清除能力也明顯高于云南黑塊菌，原因可能是河北白塊菌乙醇層提取物中含有較多具有抗氧化活性的物質(zhì)。

3．3．3 羥自由基清除能力

將水層提取物稀釋100倍，乙醇層和石油醚層提取物稀釋10倍，測(cè)定各層塊菌提取物的羥自由清除率，結(jié)果如表3所示。

表3 羥自由基清除能力

由表3可知，兩種塊菌水層提取物的羥自由基清除能力最高，并且河北白塊菌水層提取物清除能力明顯高于云南黑塊菌，與100μg/mLVC標(biāo)準(zhǔn)品清除羥自由基能力相比，河北白塊菌水層提取物是其1．49倍，云南黑塊菌是其1．13倍；二者乙醇層提取物羥自由基清除能力無(wú)顯著差異，石油醚層提取物幾乎無(wú)羥自由基清除能力。

4 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)河北白塊菌和云南黑塊菌三種不同提取物的總抗氧化能力、DPPH自由基清除能力和羥自由基清除能力進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)：兩種塊菌水層提取物的抗氧化活性均為最強(qiáng)，推測(cè)可能是水層提取物中含有較多的多糖類(lèi)等水溶性物質(zhì)。為了驗(yàn)證這一點(diǎn)，試驗(yàn)中對(duì)兩種塊菌水層提取物多糖含量進(jìn)行了測(cè)定，其中河北白塊菌多糖含量為16．54mg/g，云南黑塊菌多糖含量為4．28mg/g，初步認(rèn)為塊菌多糖含量與其抗氧化活性之間呈現(xiàn)一定的對(duì)應(yīng)關(guān)系，這與前人研究食用菌多糖具有抗氧化功效的結(jié)果一致[19-20]。乙醇層提取物和石油醚層提取物抗氧化能力較低可能是溶于乙醇和石油醚的抗氧化物質(zhì)較少。因此，對(duì)于塊菌提取物的生物活性成分、含量以及與抗氧化活性之間的關(guān)系有待于進(jìn)一步的研究。本實(shí)驗(yàn)只對(duì)塊菌提取物的抗氧化活性進(jìn)行了初步的研究，對(duì)于提取物的制備條件還有待于進(jìn)一步的優(yōu)化。同時(shí)可對(duì)不同塊菌提取物進(jìn)行體內(nèi)抗氧化能力研究，以期為其功能開(kāi)發(fā)提供一定的理論依據(jù)。