胡爭(zhēng)，李先林，瞿曦，馬進(jìn)華，張志蓓

1 湖北省第三人民醫(yī)院，武漢430000；2 湖北省榮軍醫(yī)院

前列腺癌是中老年男性泌尿生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一。中國(guó)癌癥統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，2015年前列腺癌的預(yù)期發(fā)病率和病死率分別為6.03/10萬例、2.66/10萬例[1，2]。前列腺癌早期常無明顯癥狀，大多數(shù)患者發(fā)現(xiàn)時(shí)已處于中晚期。內(nèi)分泌治療是進(jìn)展期前列腺癌首選的治療方式。但對(duì)于晚期轉(zhuǎn)移性前列腺癌或去勢(shì)抵抗前列腺癌，內(nèi)分泌治療效果較差[3]。目前，前列腺癌發(fā)病的確切分子機(jī)制尚不清楚。因此，深入研究與前列腺癌發(fā)生、發(fā)展相關(guān)的分子，對(duì)其早期診斷和靶向治療具有重要意義。微小RNA(miRNA)是真核細(xì)胞中的一類內(nèi)源性非編碼RNA，長(zhǎng)度18～25個(gè)核苷酸，雖然不具備編碼蛋白質(zhì)的功能，但可與靶基因mRNA的3′非翻譯區(qū)結(jié)合，通過改變mRNA的穩(wěn)定性，調(diào)控下游靶基因表達(dá)。近年研究發(fā)現(xiàn)，在惡性腫瘤中存在多種miRNA異常表達(dá)現(xiàn)象，其異常表達(dá)與腫瘤細(xì)胞的增殖、分化、凋亡等生物學(xué)行為密切相關(guān)[4]。miR-802是miRNA家族成員之一，定位于人染色體21q22.12。有研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌細(xì)胞miR-802表達(dá)降低，上調(diào)miR-802表達(dá)可通過抑制FoxM1表達(dá)發(fā)揮抗腫瘤作用[5，6]。RAB23是RAS原癌基因成員，定位于人染色體6p12.1。RAB23的編碼產(chǎn)物為RAS超家族的小GTP結(jié)合蛋白，能夠參與細(xì)胞內(nèi)膜運(yùn)輸，包括自噬和細(xì)菌感染免疫反應(yīng)相關(guān)多種細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)。有研究發(fā)現(xiàn)，RAB23高表達(dá)能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的浸潤(rùn)和遷移能力[7]。有研究還發(fā)現(xiàn)，RAB23是miR-802的生物學(xué)靶點(diǎn)，miR-802能夠在轉(zhuǎn)錄后水平抑制RAB23表達(dá)，從而促進(jìn)胃癌的惡性進(jìn)展[8]。但目前二者表達(dá)變化與前列腺癌發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系尚不清楚。為此，本研究觀察了前列腺癌組織miR-802、RAB23表達(dá)變化，并探討其在前列腺癌發(fā)生、發(fā)展中的作用?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2015年1月～2016年1月湖北省第三人民醫(yī)院收治的前列腺癌患者80例。所有患者經(jīng)術(shù)后組織病理檢查明確診斷。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合前列腺癌診斷，病理類型為腺癌；②初診；③接受前列腺癌根治術(shù)或腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)；④既往未接受任何抗腫瘤治療；⑤臨床病理資料和隨訪資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①非前列腺腺癌者；②合并泌尿生殖系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)等感染性疾病者；③合并其他器官或系統(tǒng)惡性腫瘤者；④合并心、肝、肺、腎等重要臟器嚴(yán)重功能不全者。患者年齡42～78(55.24±7.1)歲，其中≤65歲31歲、>65歲49例；Gleason評(píng)分：<7分36例，≥7分44例；組織分化程度：高中分化39例，低未分化41例；初始前列腺特異性抗原(PSA)水平：≤10 ng/mL 24例，>10 ng/mL 56例；臨床分期[9]：Ⅰ、Ⅱ期58例，Ⅲ、Ⅳ期22例；有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移16例，無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移64例。本研究經(jīng)湖北省第三人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者或其家屬知情同意。

1.2 miR-802、RAB23表達(dá)檢測(cè) 采用RT-qPCR技術(shù)。收集術(shù)中切除的前列腺癌組織及其配對(duì)的癌旁正常組織(距腫瘤組織邊緣>1 cm并經(jīng)組織病理檢查證實(shí)為正常前列腺組織)，置于凍存管中，液氮轉(zhuǎn)運(yùn)至-80 ℃冰箱保存，待組織成批。取前列腺癌組織與癌旁正常組織各約100 mg，采用TRIzol法提取組織總RNA，經(jīng)紫外分光光度計(jì)鑒定，提取的總RNA濃度和純度合格，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。按TaqMan miRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。反轉(zhuǎn)錄條件：16 ℃ 30 min，42 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min。以cDNA為模板，分別按SYBR Premix Ex Taq試劑盒和mirVanaTMmiRNA分離試劑盒說明進(jìn)行PCR擴(kuò)增。所有引物由上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)合成。引物序列：miR-802上游引物5′-GGACCACCGCTCGCTCATCGCTAA-3′、下游引物5′-TCGCGTTACTATATGCCAAGCCCTAG-3′，內(nèi)參U6上游引物5′-GCGCGTCGTGAAGCGTTC-3′、下游引物3′-GTGCAGGGTCCGAGGT-5′；RAB23上游引物5′-GGGGTACCCCAGATGTTTTGGGAGGAAAAC-3′、下游引物5′-GAAGATCTTCATCTAAAATGGCAAAGAGAA-3′，內(nèi)參GAPDH上游引物5′-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3′、下游引物5′-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3′。miR-802 PCR反應(yīng)體系共20 μL：cDNA模板1 μL，上下游引物各1 μL，2×Taq Master Mix 10 μL，DEPC水7 μL；反應(yīng)條件：95 ℃ 15 min，94 ℃ 30 s、55 ℃ 15 s、70 ℃ 30 s共40個(gè)循環(huán)。RAB23 PCR反應(yīng)體系共20 μL：cDNA模板1 μL，Taq DNA聚合酶0.125 μL，上下游引物各1 μL，20×SYBR Green 1 μL，25 mmol/L dNTPs 1 μL，DEPC水補(bǔ)足至20 μL；反應(yīng)條件：95 ℃ 2 min，94 ℃ 15 s、60 ℃ 20 s、72 ℃ 10 s共40個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.3 隨訪 所有患者自出院后采用門診、電話等形式隨訪，1～3個(gè)月隨訪1次，隨訪截至2019年1月，終點(diǎn)事件為患者死亡，統(tǒng)計(jì)患者生存情況，計(jì)算3年總體生存率。

2 結(jié)果

2.1 前列腺癌組織與癌旁正常組織miR-802、RAB23表達(dá)比較 前列腺癌組織與癌旁正常組織miR-802相對(duì)表達(dá)量分別為1.230±0.246、1.731±0.215，RAB23相對(duì)表達(dá)量分別為1.041±0.210、0.467±0.118。前列腺癌組織miR-802相對(duì)表達(dá)量低于癌旁正常組織，RAB23相對(duì)表達(dá)量高于癌旁正常組織(t分別為13.716、21.313，P均<0.05)。

2.2 前列腺癌組織miR-802表達(dá)與RAB23表達(dá)的關(guān)系 Pearson線性相關(guān)分析顯示，前列腺癌組織miR-802相對(duì)表達(dá)量與RAB23相對(duì)表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(r=-0.626，P<0.05)。

2.3 前列腺癌組織miR-802、RAB23表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系 見表1。

表1 前列腺癌組織miR-802、RAB23表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系

2.4 不同miR-802、RAB23表達(dá)與前列腺癌患者預(yù)后的關(guān)系 截至隨訪日期，共隨訪3～48個(gè)月、中位隨訪時(shí)間32個(gè)月，隨訪期間死亡46例，無失訪。

以前列腺癌組織miR-802相對(duì)表達(dá)量的均數(shù)1.226為臨界值，將患者分為miR-802高表達(dá)者38例、低表達(dá)者42例。miR-802高表達(dá)者3年總體生存率為65.8%(25/38)，miR-802低表達(dá)者為50.0%(21/42)。miR-802高表達(dá)者3年總體生存率與miR-802低表達(dá)者比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=3.214，P>0.05)。

以前列腺癌組織RAB23相對(duì)表達(dá)量的均數(shù)1.045為臨界值，將患者分為RAB23高表達(dá)者44例、低表達(dá)者36例。RAB23高表達(dá)者3年總體生存率為36.4%(19/44)，RAB23低表達(dá)者為75.0%(27/36)。RAB23高表達(dá)者3年總體生存率低于RAB23低表達(dá)者(χ2=4.861，P<0.05)。

3 討論

前列腺癌是中老年男性泌尿生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一。近年來前列腺癌的發(fā)病率不斷升高，已成為威脅男性健康的第二大惡性腫瘤。前列腺癌早期通過根治性手術(shù)或根治性放療等手段，可達(dá)到較好的治療效果，甚至治愈[10]。由于前列腺癌早期常無明顯癥狀，大多數(shù)患者發(fā)現(xiàn)時(shí)已處于中晚期，內(nèi)分泌治療成為其首選的治療方式。但對(duì)于晚期轉(zhuǎn)移性前列腺癌或去勢(shì)抵抗前列腺癌，內(nèi)分泌治療效果較差[3]。因此，深入探索與前列腺癌發(fā)生、發(fā)展相關(guān)的分子，對(duì)其早期診斷和靶向治療具有重要意義。

miRNA是一種內(nèi)源性單鏈小分子RNA，主要參與基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，在多細(xì)胞生物的發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用。研究證實(shí)，在肝癌、前列腺癌等惡性腫瘤中存在miRNA異常表達(dá)現(xiàn)象，通過檢測(cè)組織或血清miRNA表達(dá)有助于腫瘤的早期診斷[11]。miR-802是miRNA家族成員之一，定位于人染色體21q22.12。miR-802可參與構(gòu)成RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物(RISC)，而RISC能夠通過不完全堿基配對(duì)的方式識(shí)別靶mRNA，導(dǎo)致靶mRNA的翻譯抑制或去穩(wěn)定化[12]。研究表明，miR-802在舌鱗癌、肝癌等惡性腫瘤中存在表達(dá)下調(diào)現(xiàn)象，其異常表達(dá)可引起其靶基因MAP2K4表達(dá)升高，從而導(dǎo)致腫瘤惡性進(jìn)展[13]。RAB23是RAS原癌基因成員，定位于人染色體6p12.1。RAB23的編碼產(chǎn)物為RAS超家族的小GTP結(jié)合蛋白，通過促進(jìn)囊泡運(yùn)輸和控制溶酶體內(nèi)吞等參與細(xì)胞內(nèi)膜運(yùn)輸。有研究報(bào)道，RAB23可通過整合素β1/Rac1信號(hào)途徑促進(jìn)鱗癌細(xì)胞侵襲和遷移[7]。有研究還發(fā)現(xiàn)，RAB23是miR-802的生物學(xué)靶點(diǎn)，miR-802能夠在轉(zhuǎn)錄后水平抑制RAB23表達(dá)，從而促進(jìn)胃癌的惡性進(jìn)展[8]。但目前二者表達(dá)變化與前列腺癌發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系尚不清楚。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，前列腺癌組織miR-802相對(duì)表達(dá)量低于癌旁正常組織，其表達(dá)下調(diào)一方面可能與miR-802基因位點(diǎn)的雜合性缺失有關(guān)，一方面可能與miR-802基因的甲基化、乙?；缺碛^遺傳學(xué)修飾有關(guān)[14]。本研究結(jié)果顯示，前列腺癌組織miR-802相對(duì)表達(dá)量與Gleason評(píng)分、臨床分期有關(guān)，而與年齡、初始PSA水平、組織分化程度和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移無關(guān)，提示miR-802有可能參與前列腺癌的惡性進(jìn)展，其機(jī)制可能與miR-802對(duì)靶基因Flotillin-2抑制作用降低，導(dǎo)致Flotillin-2表達(dá)增加，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，最終導(dǎo)致腫瘤惡性進(jìn)展[15]。本研究進(jìn)一步分析了不同miR-802表達(dá)與前列腺癌患者預(yù)后的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-802高表達(dá)者3年總體生存率與miR-802低表達(dá)者比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明miR-802并非影響前列腺癌患者預(yù)后的關(guān)鍵因素。這可能與本研究隨訪時(shí)間較短有關(guān)。此外，腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中存在多種miRNA異常表達(dá)現(xiàn)象，一種癌基因可同時(shí)受多種miRNA調(diào)控，而同一種miRNA亦能調(diào)控多種靶基因，從而形成復(fù)雜的miRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)[16]。

RAB23是Hedgehog信號(hào)途徑重要的負(fù)性調(diào)節(jié)因子。RAB23表達(dá)增加可誘導(dǎo)細(xì)胞G1期阻滯，從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞凋亡減少。RAB23表達(dá)還能促進(jìn)Gli1、Gli2表達(dá)，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖[17]。有研究表明，RAB23在肝癌、胃癌等惡性腫瘤細(xì)胞中表達(dá)升高，沉默RAB23表達(dá)后腫瘤細(xì)胞的侵襲和遷移能力明顯下降[18]。有學(xué)者通過TargetScan對(duì)miR-802的靶點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)RAB23是miR-802潛在的作用靶點(diǎn)，進(jìn)一步通過熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證RAB23是miR-802的直接作用靶基因，通過siRNA技術(shù)敲除miR-802表達(dá)后，RAB23表達(dá)降低[8]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，前列腺癌組織RAB23相對(duì)表達(dá)量高于癌旁正常組織；相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，前列腺癌組織RAB23相對(duì)表達(dá)量與miR-802相對(duì)表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。提示miR-802表達(dá)下降能夠通過促進(jìn)RAB23表達(dá)增加，從而促進(jìn)前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，前列腺癌組織RAB23相對(duì)表達(dá)量與Gleason評(píng)分、臨床分期有關(guān)，而與年齡、初始PSA水平、組織分化程度和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移無關(guān)。提示RAB23可能參與前列腺癌的惡性進(jìn)展，其機(jī)制可能是RAB23對(duì)Hedgehog信號(hào)途徑的抑制作用減弱，從而促進(jìn)腫瘤的局部浸潤(rùn)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。此外，RAB23還可直接促進(jìn)轉(zhuǎn)移相關(guān)因子Rac1表達(dá)，從而促進(jìn)前列腺癌轉(zhuǎn)移[19]。本研究還發(fā)現(xiàn)，RAB23高表達(dá)者3年總體生存率低于RAB23低表達(dá)者，提示RAB23高表達(dá)與前列腺癌患者預(yù)后不良有關(guān)。因此，RAB23有可能成為評(píng)估前列腺癌患者預(yù)后的分子生物標(biāo)志物。

綜上所述，前列腺癌組織miR-802低表達(dá)、RAB23高表達(dá)，二者表達(dá)變化與前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展和患者預(yù)后有關(guān)。miR-802、RAB23有望成為前列腺癌早期診斷、靶向治療和預(yù)后評(píng)估的分子生物標(biāo)志物。