方碩，余鈴，郭衛(wèi)春

武漢大學(xué)人民醫(yī)院，武漢 430060

骨肉瘤是最常見的原發(fā)性骨惡性腫瘤，在世界范圍內(nèi)的發(fā)病率為百萬分之一至三。該病主要發(fā)生于兒童和青少年，50歲以上人群有第二個(gè)發(fā)病高峰[1]。骨肉瘤的主要治療方法是手術(shù)切除。然而，僅手術(shù)治療骨肉瘤患者的生存率為15%～17%[2]。20世紀(jì)70年代早期，高劑量甲氨蝶呤和長春新堿及葉酸被引入輔助化療，以輔助手術(shù)切除，使得非轉(zhuǎn)移性骨肉瘤患者的生存率提高了兩倍。目前的治療方法包括手術(shù)切除和聯(lián)合化療(阿霉素和順鉑加或不加甲氨蝶呤)，可治愈70%的患者[3]。然而，在過去的30年中，轉(zhuǎn)移性或復(fù)發(fā)性骨肉瘤患者的生存率幾乎無變化，總體5年生存率約為20%。中藥天然產(chǎn)物中的抗癌藥物已引起國際廣泛關(guān)注。蟾酥是一種從蟾蜍的皮膚和腮腺中提取的中藥，沙蟾毒精是蟾酥的主要活性成分之一[4]。沙蟾毒精最初被認(rèn)為是一種強(qiáng)效的Na+-K+泵抑制劑，具有阻斷心肌細(xì)胞Na+-K+泵的能力[5]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，沙蟾毒精在某些惡性腫瘤中具有潛在的抗腫瘤活性。Deng等[6]發(fā)現(xiàn)，沙蟾毒精可通過激活YAP的促凋亡活性來抑制MCF-7乳腺癌增殖；Chen等[7]研究表明，沙蟾毒精能抑制β-catenin表達(dá)，從而減少前列腺癌轉(zhuǎn)移。然而，其抗骨肉瘤作用及其潛在機(jī)制少見報(bào)道。2018年8月～2019年9月，本研究通過觀察不同濃度沙蟾毒精對(duì)人骨肉瘤U2OS細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲和轉(zhuǎn)移的影響，初步探討沙蟾毒精抗骨肉瘤的相關(guān)機(jī)制，為沙蟾毒精進(jìn)一步臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 沙蟾毒精購自美國Sigma-Aldrich公司；cell counting kit-8(CCK-8)購自北京索萊寶公司；Hoechst 33258購自美國Sigma-Aldrich公司；Transwell小室購自美國Corning公司；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購自美國Hyclone公司；青鏈霉素和PBS購自武漢谷歌公司；TRIzol試劑購自美國Invitrogen公司；RT-PCR試劑盒購自美國Thermo公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 人骨肉瘤U2OS細(xì)胞系購于中國典型培養(yǎng)物保藏中心；細(xì)胞采用含10%胎牛血清和1%青鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)；細(xì)胞培養(yǎng)于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中，每天換液，間日傳代，取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3 細(xì)胞抑制率測(cè)算及沙蟾毒精濃度篩選 采用CCK-8細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)。U2OS細(xì)胞采用胰酶消化，制成細(xì)胞懸液，并稀釋至3.5×104個(gè)/mL。在96孔細(xì)胞板中標(biāo)記，并在每孔中加入200 μL細(xì)胞稀釋懸液，培養(yǎng)24 h待細(xì)胞貼壁后，按照標(biāo)記分別加入不同總濃度的沙蟾毒精(0、25、50、75、100、125、150、175、200 nmol/L)。處理24 h后，吸出培養(yǎng)基，每孔加入含10% CCK-8的完全培養(yǎng)基100 μL培養(yǎng)2 h，酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm處OD值，并計(jì)算細(xì)胞抑制率。發(fā)現(xiàn)0、25、50、75、100、125、150、175、200 nmol/L沙蟾毒精作用U20S細(xì)胞24 h的增殖抑制率分別為(0.38±1.63)%、(15.67±4.61)%、(25.73±3.72)%、(37.46±3.89)%、(45.31±2.05)%、(52.79±2.47)%、(57.56±3.66)%、(63.18±5.25)%、(66.16±4.28)%，各濃度兩兩相比P均<0.01。沙蟾毒精處理U2OS細(xì)胞24 h的半抑制濃度(IC50)為107.8 nmol/L。因此，本研究以50、100、150 nmol/L的沙蟾毒精處理U2OS細(xì)胞24 h進(jìn)行后續(xù)的機(jī)制研究。

1.4 細(xì)胞凋亡情況觀察 采用Hoechst 33258檢測(cè)。將U2OS細(xì)胞接種于6孔板中，采用0、50、100、150 nmol/L的沙蟾毒精處理U2OS細(xì)胞24 h，然后PBS漂洗2次，采用4%多聚甲醇固定20 min，PBS沖洗，Hoechst 33258避光染色10 min，采用熒光顯微鏡觀察結(jié)果。

1.5 細(xì)胞侵襲能力觀察 采用Transwell法檢測(cè)沙蟾毒精對(duì)U2OS細(xì)胞侵襲能力的影響。Transwell小室預(yù)先采用基質(zhì)膠包被，采用0、50、100、150 nmol/L的沙蟾毒精處理U2OS細(xì)胞24 h后胰酶消化并收集細(xì)胞，將不含胎牛血清的1×105個(gè)細(xì)胞置于Transwell小室上層，小室下層中加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)基800 μL，然后將Transwell系統(tǒng)放入37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。用棉簽擦去小室內(nèi)側(cè)的細(xì)胞，將小室外側(cè)的細(xì)胞采用結(jié)晶紫染色20 min，在顯微鏡下觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果，并計(jì)算細(xì)胞穿過小室膜的數(shù)量。

1.6 細(xì)胞Bax、Bcl-2、caspase-3、MMP-2、MMP-9 mRNA表達(dá)檢測(cè) 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)。采用0、50、100、150 nmol/L的沙蟾毒精處理U2OS細(xì)胞24 h，應(yīng)用TRIzol法提取細(xì)胞總RNA，參照試劑盒說明逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA并擴(kuò)增合成目的片段。以β-actin作為內(nèi)參目的基因，通過觀察擴(kuò)增曲線來測(cè)量相關(guān)mRNA的CT值。引物序列如下：Bax正向引物為5′-GAAGCCGGTGGTGGAGAA-3′，反向引物為5′-GCTTGGAGTTGGGCTGGTG-3′；Bcl-2正向引物為5′- GAAGCAGGTAATGGAGCAAGGA-3′，反向引物為5′-GAAGCGTAGTTGTTGAGATGCG-3′；caspase-3正向引物為5′-GCGGTTGTAGAAGTTAATAAAGGTA-3′，反向引物為5′-CATGGCACAAAGCGACTGG-3′；MMP-2正向引物為5′-GAGTGCATGAACCAACCAGC-3′，反向引物為5′-AAACTTGCAGGGCTGTCCTT-3′；MMP-9正向引物為5′-TCTATGGTCCTCGCCCTGAA-3′，反向引物為5′-TTGTATCCGGCAAACTGGCT-3′；β-actin正向引物為5′-GTCCACCGCAAATGCTTCTA-3′，反向引物為5′-TGCTGTCACCTTCACCGTTC-3′。以2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 沙蟾毒精對(duì)U2OS細(xì)胞凋亡的影響 Hoechst 33258染色顯示，0 nmol/L沙蟾毒精處理U2OS細(xì)胞24 h后，細(xì)胞核完整，染色質(zhì)均勻；50、100、150 nmol/L處理后細(xì)胞核裂解，染色質(zhì)凝聚、固縮，產(chǎn)生凋亡小體。隨著處理濃度增加，鏡下細(xì)胞明顯減少，并且出現(xiàn)細(xì)胞核固縮，碎裂的細(xì)胞數(shù)量增加。

2.2 沙蟾毒精對(duì)U2OS細(xì)胞侵襲能力的影響 0、50、100、150 nmol/L沙蟾毒精處理U2OS細(xì)胞透膜數(shù)分別為(270.33±13.05)、(206.00±18.08)、(128.67±17.79)、(82.67±15.01)個(gè)，兩兩相比P均<0.05。

2.3 沙蟾毒精對(duì)U2OS細(xì)胞凋亡、侵襲相關(guān)基因表達(dá)的影響 見表1。

表1 不同濃度沙蟾毒精處理后U2OS細(xì)胞凋亡、侵襲相關(guān)基因表達(dá)比較

注: 與0 nmol/L比較，#P<0.01。

3 討論

骨肉瘤是最常見的骨惡性腫瘤之一，主要發(fā)生于青少年。隨著80年代化療的引入，骨肉瘤患者的5年生存率近年來有了顯著提高。術(shù)前、術(shù)后化療已成為骨肉瘤患者的標(biāo)準(zhǔn)治療方法。然而，骨肉瘤患者使用的藥物在近幾十年基本保持不變，如甲氨蝶呤和順鉑，其效果仍不理想[8]。因此，尋找新的有效藥物來提高骨肉瘤患者的生存率和生活質(zhì)量至關(guān)重要。

蟾酥是我國傳統(tǒng)中藥，被列入《中國藥典》，具有強(qiáng)心、鎮(zhèn)痛、抗腫瘤等多種藥理活性。沙蟾毒精是從蟾酥中提取的一種甾體類化合物，是蟾酥主要活性成分之一[9]。目前研究發(fā)現(xiàn)，沙蟾毒精能夠抑制非小細(xì)胞肺癌、胰腺癌、前列腺癌等不同類型的人類腫瘤細(xì)胞的生長、轉(zhuǎn)移，并誘導(dǎo)凋亡。沙蟾毒精通過Noxa相關(guān)通路誘導(dǎo)人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞凋亡[10]；沙蟾毒精可以誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞凋亡和G2/M期阻滯，并增強(qiáng)胰腺癌細(xì)胞對(duì)化療的敏感性[11]。但沙蟾毒精對(duì)骨肉瘤的影響及機(jī)制尚不清楚。

本研究采用不同濃度的沙蟾毒精處理人骨肉瘤細(xì)胞系U2OS，并采用CCK-8法檢測(cè)其增殖情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)低濃度(25 nmol/L)的沙蟾毒精即可明顯抑制U2OS細(xì)胞增殖，且隨著處理濃度的增加，抑制效果增加。提示沙蟾毒精能夠抑制骨肉瘤細(xì)胞的增殖。

細(xì)胞凋亡在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中起重要作用，很多藥物是通過誘導(dǎo)腫瘤凋亡來抑制腫瘤的進(jìn)展[12]。細(xì)胞的許多形態(tài)變化表明細(xì)胞凋亡的發(fā)生，包括細(xì)胞收縮、膜泡化、細(xì)胞核碎裂和縮聚以及凋亡小體的形成。為了研究沙蟾毒精是否能夠誘導(dǎo)U2OS細(xì)胞的凋亡，本研究采用Hoechst 33258染色來檢測(cè)細(xì)胞核形態(tài)的改變。結(jié)果顯示，未經(jīng)沙蟾毒精處理的細(xì)胞細(xì)胞核均一，完整；經(jīng)過沙蟾毒精處理后的U2OS細(xì)胞清晰可見亮藍(lán)色熒光，細(xì)胞核濃縮、破碎[13]。這進(jìn)一步證實(shí)沙蟾毒精可以誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞凋亡。

Bax和caspase-3為凋亡相關(guān)基因，Bcl-2為抗凋亡相關(guān)基因[14]。為探討沙蟾毒精誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制，本研究采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)凋亡相關(guān)mRNA表達(dá)變化。這些基因表達(dá)與線粒體介導(dǎo)的凋亡通路有關(guān)，Bcl-2能夠阻止細(xì)胞凋亡，Bax能夠通過Bcl-2結(jié)合并拮抗其作用，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡[15]。實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示，沙蟾毒精能夠顯著促進(jìn)U2OS細(xì)胞凋亡相關(guān)基因Bax和caspase-3 mRNA的表達(dá)，并抑制抗凋亡相關(guān)基因Bcl-2 mRNA的表達(dá)。沙蟾毒精促進(jìn)Bax表達(dá)并抑制Bcl-2表達(dá)，增加了線粒體膜的通透性，隨后激活caspase-3，并產(chǎn)生剪切，最終誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[16]。推測(cè)沙蟾毒精可能通過線粒體途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

除了細(xì)胞增殖外，侵襲和轉(zhuǎn)移被認(rèn)為是惡性腫瘤的兩個(gè)重要生物學(xué)特征。細(xì)胞遷移和侵襲在腫瘤轉(zhuǎn)移中起重要作用[17]。本研究Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著沙蟾毒精濃度的增加，U2OS細(xì)胞的穿膜數(shù)量減少，說明沙蟾毒精能夠抑制骨肉瘤細(xì)胞的侵襲能力。腫瘤轉(zhuǎn)移需要首先降解細(xì)胞外基質(zhì)并穿過細(xì)胞膜，MMPs已被證實(shí)參與大多數(shù)細(xì)胞外基質(zhì)的降解。MMP-2和MMP-9為侵襲與轉(zhuǎn)移相關(guān)基因[18]，被證實(shí)參與骨肉瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移[19,20]。實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示，沙蟾毒精能夠顯著抑制U2OS細(xì)胞MMP-2和MMP-9 mRNA的表達(dá)，部分證實(shí)沙蟾毒精抑制骨肉瘤細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移的機(jī)制。

綜上所述，沙蟾毒精能抑制U2OS細(xì)胞增殖；可能通過線粒體凋亡途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，其機(jī)制與促進(jìn)Bax、caspase-3表達(dá)和抑制Bcl-2表達(dá)有關(guān)；能夠抑制細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移，其機(jī)制與抑制MMP-2和MMP-9表達(dá)有關(guān)。總之，本研究為骨肉瘤治療提供了新的方向，為進(jìn)一步深入研究沙蟾毒精治療骨肉瘤提供了基礎(chǔ)。