王翅遙,張傳朋,張會濤,趙 佩,陳蕊蕊*

(1空軍軍醫(yī)大學唐都醫(yī)院心內(nèi)科,西安 710032;2中國人民解放軍第九四八醫(yī)院心內(nèi)科;3周至聯(lián)合醫(yī)院;*通訊作者,E-mail:ruirui317@163.com)

國際糖尿病聯(lián)盟和WHO數(shù)據(jù)顯示,糖尿病已經(jīng)超越癌癥,成為危害人類健康的重要疾病(http://www.diabetesatlas.org)。糖尿病心血管并發(fā)癥是糖尿病致死致殘的首要原因,主要包括動脈粥樣硬化、冠心病、心衰和糖尿病心肌病[1]。糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy,DCM)是指發(fā)生于糖尿病患者,不依賴于其他心血管疾病發(fā)生的心衰綜合征[2]。研究表明,糖尿病是心衰的獨立危險因素,糖尿病患者罹患心衰的比率是非糖尿病人群的2-4倍[3]。DCM的發(fā)病機制尚不明確,目前已知的主要有代謝障礙、氧化應(yīng)激、線粒體功能損傷、鈣穩(wěn)態(tài)紊亂和糖基化異常等[4],探討糖尿病心肌病的發(fā)病機制,提出針對性的干預(yù)策略,對糖尿病心肌病的治療具有重要意義。

丹酚酸(salvianolic acids)是丹參(拉丁學名:SalviamiltiorrhizaBunge)中含量最豐富的水溶性物質(zhì),而丹酚酸B(SalB)則是丹酚酸中含量最多、生物活性最強的化合物[5]。多項基礎(chǔ)研究表明,丹酚酸B對于多種心血管疾病均有潛在的治療效果。丹酚酸B能夠通過提高組織內(nèi)超氧化物歧化酶的活性和含量,降低組織氧化應(yīng)激水平,對抗心梗和缺血再灌注造成的心肌損傷并抑制動脈粥樣硬化板塊的形成[6-9]。此外,丹酚酸B對心肌肥大和心肌組織炎癥反應(yīng)也有一定的抑制效果[10]。然而,丹酚酸B是否能夠減輕糖尿病心肌損傷及其具體機制尚不得而知。本研究通過建立糖尿病動物和細胞模型,觀察丹酚酸B對于糖尿病心肌組織的影響,并探尋其具體機制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 動物 SPF級野生型C57BL小鼠30只,鼠齡8周齡,體質(zhì)量20-25 g,購自常州卡文斯模式動物中心。

1.2 方法

1.2.1 糖尿病模型小鼠的建立 30只8周齡雄性C57BL小鼠隨機分為3組:對照組(Con組)、糖尿病組(DM組)和糖尿病+SalB組(DM+SalB組),每組10只。參考科室前期研究[11],在DM組和DM+SalB組小鼠8周齡時,以60 mg/kg劑量腹腔注射STZ,連續(xù)注射5 d,注射完畢1周后進行小鼠血糖檢測,以空腹血糖大于11.1 mmol/L為糖尿病小鼠模型構(gòu)建成功。繼續(xù)普食喂養(yǎng)12周以誘導糖尿病心肌病,所有小鼠均自由進食飲水。其中,DM+SalB組在糖尿病造模成功后繼續(xù)給予15 mg/(kg·d)SalB腹腔注射連續(xù)注射2周,其余兩組注射等量生理鹽水。持續(xù)監(jiān)測小鼠血糖,12周后超聲心動圖檢測小鼠心臟功能。

1.2.2 原代心肌細胞的提取和培養(yǎng) 選擇1-3日齡SD大鼠的乳鼠,放入75%酒精溶液充分浸泡消毒,剪開胸腔取出心臟,放入PBS溶液中洗去殘留血液,將取出的心臟充分剪碎,加入Ⅰ型膠原酶37 ℃消化6次,每次5 min,取消化液離心重懸并鋪板,48 h后換液處理。對照組(Con組)給與含5.5 mmol/L葡萄糖+10% FBS的培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h;糖尿病細胞模型組(HG組)給與含33 mmol/L葡萄糖+10% FBS的培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h;HG+SalB組在HG組基礎(chǔ)上,培養(yǎng)基中加入20 μmol/L SalB培養(yǎng);HG+SalB+si-SIRT1組在高糖和SalB處理之前,應(yīng)用小感染RNA對SIRT1表達進行干擾,具體步驟見1.2.6。由此將細胞共分為Con組、HG組、HG+SalB組和HG+SalB+si-SIRT1組。

1.2.3 超聲心動圖檢測小鼠心臟功能 在各組小鼠達到16周齡時,使用小動物高分辨率超聲儀檢測小鼠心臟功能。異氟烷持續(xù)吸入麻醉小鼠,于37 ℃的恒溫墊上固定小鼠,將小鼠四肢末端用4個電極連接。獲取胸骨旁長軸切面M型超聲圖像,將6個持續(xù)心動周期的平均值保留為原始數(shù)據(jù),保存數(shù)據(jù),測算小鼠左心室射血分數(shù)(LVEF)。

1.2.4 Western blot檢測SIRT1、剪切的Caspase3蛋白水平 將分離清洗完畢的組織用PBS洗滌3次,充分研磨,全程4 ℃低溫操作。加入裂解液RIPA提取蛋白,根據(jù)蛋白定量結(jié)果調(diào)整上樣體積。按照操作流程進行SDSPAGE蛋白電泳,并轉(zhuǎn)膜至NC膜上。配置5%脫脂奶粉封閉孵育1 h,TBST液洗3次,過夜孵育β-actin、SIRT1、剪切的Caspase3一抗(稀釋比例1 ∶1 000),TBST液洗3次,滴加山羊抗兔IgG抗體孵育2 h,TBST液洗3次。用化學發(fā)光法檢測目的蛋白條帶,并用Bio-Rad成像系統(tǒng)記錄并分析,以β-actin為內(nèi)參標化各蛋白表達的水平。

1.2.5 凋亡檢測 將取下的心臟標本置于4%中性甲醛溶液中,常規(guī)石蠟包埋,制作4 μm的切片,使用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶dUTP缺口末端標記(TUNEL)測定試劑盒(美國羅氏公司)檢測心肌細胞,所有操作均按照試劑盒說明書嚴格執(zhí)行,染色封片后在激光共聚焦顯微鏡下觀察并拍照。細胞凋亡檢測采用美國BD公司PE-Annixin Ⅴ細胞凋亡檢測試劑盒。將貼壁的細胞消化至細胞懸液,離心清洗獲得細胞團,PBS溶液重懸細胞,并按照說明書操作規(guī)范進行染色上機,流式細胞儀分析獲得數(shù)據(jù)。

1.2.6 siRNA干擾沉默調(diào)節(jié)蛋白1(SIRT1)表達 SIRT1 siRNA購自美國CST公司,使用LipofectamineTMRNAiMAX轉(zhuǎn)染試劑進行RNA轉(zhuǎn)染。簡而言之,在轉(zhuǎn)染前準備了兩個試管,一個試管包含DMEM培養(yǎng)基和RNAiMAX轉(zhuǎn)染,另一管含有DMEM和SIRT1 siRNA。然后,將兩個試管中的內(nèi)容物輕輕混合在一起,并在室溫下孵育5 min,即可進行轉(zhuǎn)染,轉(zhuǎn)染siRNA 48 h后即可處理干預(yù)細胞。細胞干預(yù)分組見1.2.2。

1.2.7 Mito-SOX檢測線粒體氧化應(yīng)激水平 按照說明書操作步驟制備線ROS染色工作液,直接向細胞培養(yǎng)基中滴加2 μl/ml的Mito-SOX染色工作液進行染色,放入孵箱中避光孵育30 min,即可在共聚焦顯微鏡下觀察。

2 結(jié)果

2.1 SalB對糖尿病小鼠心臟功能和心肌組織SIRT1表達量的影響

相比于造模前,糖尿病(DM)組血糖顯著升高(P<0.05),體質(zhì)量顯著降低(P<0.05),表明糖尿病模型造模成功。然而,相比于DM組,造模后DM+SalB組血糖和體質(zhì)量均未發(fā)生顯著改變(見圖1),表明外源性SalB不能降低糖尿病小鼠血糖水平。超聲檢測結(jié)果表明,相比于Con組,DM組小鼠心臟功能顯著降低,表現(xiàn)在DM組小鼠左心室射血分數(shù)顯著低于Con組小鼠(41.2±4.4vs72.7±6.2,P<0.05);相比于單純DM組,DM+SalB組小鼠心臟功能出現(xiàn)了顯著的改善,心臟左室射血分數(shù)顯著增高(41.2±4.4vs54.6±5.8,P<0.05,見圖2)。伴隨著心臟功能的降低,Western blot結(jié)果顯示DM小鼠心肌的SIRT1表達量出現(xiàn)了顯著的下降(P<0.05,見圖2),外源性SalB顯著上調(diào)了DM小鼠心肌組織SIRT1的表達,表明SalB改善心臟功能的作用很可能是通過上調(diào)SIRT1表達量實現(xiàn)的。

與8周齡相比,*P<0.05

與Con組相比,*P<0.05;與DM相比,#P<0.05

2.2 SalB對糖尿病小鼠心肌組織凋亡水平的影響

TUNEL檢測結(jié)果顯示,相比于Con組,DM組小鼠心肌組織凋亡水平出現(xiàn)了顯著上升,具體地,DM組小鼠心肌組織TUNEL染色陽性率和剪切的Caspase3的表達量均出現(xiàn)顯著的上升(P<0.05),外源性SalB則顯著降低了DM小鼠心肌組織的凋亡水平(見圖3)。

與Con組相比,*P<0.05;與DM組相比,#P<0.05

2.3 干擾SIRT1對SalB改善心肌組織凋亡作用的影響

為了驗證SalB是否通過提高SIRT1表達改善DM小鼠心臟功能,我們分離了原代心肌細胞并用si-SIRT1干擾SIRT1表達進行了細胞實驗。結(jié)果顯示,相比于Con組,高糖培養(yǎng)組心肌細胞SIRT1表達量出現(xiàn)了顯著下降。流式細胞儀檢測顯示,心肌細胞凋亡指數(shù)也出現(xiàn)了顯著上升(P<0.05)。SalB處理顯著上調(diào)了高糖培養(yǎng)心肌細胞SIRT1的表達量,并降低了心肌細胞凋亡水平(P<0.05)。si-SIRT1處理顯著降低了HG+SalB培養(yǎng)細胞SIRT1的表達,同時心肌細胞的凋亡水平也出現(xiàn)了顯著上升(P<0.05,見圖4,5),表明si-SIRT1可以消除SalB對于糖尿病心肌細胞凋亡的抑制作用。

2.4 干擾SIRT對SalB改善心肌組織氧化應(yīng)激作用的影響

Mito-SOX熒光染色顯示,相比于Con組,HG組心肌細胞線粒體氧化應(yīng)激水平出現(xiàn)了顯著上升,HG組心肌細胞熒光強度出現(xiàn)了顯著升高。HG+SalB組較HG組心肌細胞線粒體氧化應(yīng)激水平降低，HG+SalB+si-SIRT1組較HG+SalB組的線粒體氧化應(yīng)激水平上升(P<0.05,見圖6)。

與Con組相比,*P<0.05;與HG組相比,#P<0.05;與HG+SalB組相比,&P<0.05

圖5 流式細胞儀檢測原代心肌細胞凋亡水平 (n=4-6)

圖6 Mito-SOX染色檢測原代心肌細胞線粒體氧化應(yīng)激水平 (n=4-6)

3 討論

Sirtuin家族是細胞內(nèi)最重要的去乙酰化酶,在細胞代謝調(diào)節(jié)、信號轉(zhuǎn)導、衰老等眾多生理過程中發(fā)揮重要作用。SIRT1是Sirtuin家族的重要成員,廣泛參與著心肌細胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄活性調(diào)節(jié)、能量代謝等眾多生理過程。近年來研究表明,SIRT1在心肌細胞線粒體功能調(diào)節(jié)方面有其獨特作用。SIRT1能夠顯著增強心肌細胞線粒體抗氧化應(yīng)激能力、線粒體生物合成以及抗凋亡能力[15]。在DCM的發(fā)病過程中,SIRT1也發(fā)揮著重要作用。Ding等[16]的研究表明,在Ⅰ型糖尿病心肌組織中,SIRT1的表達量顯著下調(diào)。上調(diào)SIRT1則可以通過降低線粒體分裂蛋白Drp1的表達抑制線粒體過度分裂,進一步降低線粒體氧化應(yīng)激程度改善線粒體功能,發(fā)揮其心肌保護作用。本研究也表明,SalB能夠通過激活SIRT1表達改善糖尿病心肌組織凋亡和氧化應(yīng)激程度,最終改善糖尿小鼠心臟功能。

丹參及其提取物一直被廣泛應(yīng)用于心血管疾病的治療。丹酚酸是丹參中含量最豐富的水溶性物質(zhì),而丹酚酸B(SalB)則是丹酚酸中含量最多、生物活性最強的化合物。研究表明,SalB對動脈粥樣硬化、心肌梗死、心肌缺血再灌注損傷、高血壓等心血管疾病均具有保護作用。由于心血管疾病的發(fā)病機制存在很多共通之處,SalB在DCM防治中可能存在巨大潛力。既往研究發(fā)現(xiàn),SalB能夠明顯提高缺血再灌注大鼠心肌組織中超氧化物歧化酶的活性,從而降低缺血再灌注心肌組織的氧化應(yīng)激水平,抵抗氧自由基造成的心肌細胞損傷。同時,SalB能夠抑制心肌梗死后心肌組織凋亡,從而減輕大鼠心肌梗死后心臟功能損傷[6-8]。本研究表明,在原代心肌細胞中,SalB能夠有效對抗由高糖培養(yǎng)誘導的心肌細胞氧化應(yīng)激損傷,同時抑制由高糖誘導的心肌細胞凋亡,最終改善小鼠心臟功能。本研究進一步指出,SalB對于糖尿病心肌損傷的保護作用可能是通過提高心肌組織SIRT1含量發(fā)揮的。SalB能夠同時在動物和細胞水平提高SIRT1的表達,并降低凋亡和氧化應(yīng)激水平。在細胞水平使用si-SIRT1干擾SIRT1的表達后,SalB對于原代心肌細胞的保護作用被大部分消除,這表明SalB的保護作用很有可能是通過激活SIRT1表達發(fā)揮的。

本研究也存在著一定的局限性。首先,DCM的發(fā)病機制極其復雜,SalB是否通過激活其他分子發(fā)揮其保護作用還有待進一步研究;其次,SalB通過何種方式激活SIRT1表達及其具體調(diào)控機制尚不明確。

本研究在動物和細胞兩個水平證實:外源性SalB可能通過激活SIRT1表達,進一步降低糖尿病小鼠心肌組織凋亡和氧化應(yīng)激水平,減輕心肌細胞損傷,發(fā)揮其心肌保護作用。本研究為臨床應(yīng)用丹參提取物SalB治療DCM患者提供了實驗依據(jù),為DCM的治療提供了新的中醫(yī)藥治療方案。