蔣婉婷,李令民,張 旗,喬敏霞

(西安市第四醫(yī)院超聲影像科,西安 710004;*通訊作者,E-mail:qmx12306@126.com)

脊髓損傷(spinal cord injury,SCI)是臨床常見的一種疾病,近年來隨著交通業(yè)的發(fā)展,其發(fā)生率逐漸接近發(fā)達(dá)國家水平[1]。SCI分為原發(fā)性損傷和繼發(fā)性損傷,原發(fā)性損傷在受傷即刻發(fā)生,沒有有效的治療方式;繼發(fā)性損傷是在原發(fā)性損傷的基礎(chǔ)上出現(xiàn)局部的缺血、水腫、氧化應(yīng)激等改變,這些病理過程往往導(dǎo)致局部微環(huán)境紊亂,進(jìn)而出現(xiàn)神經(jīng)營養(yǎng)因子的缺乏,最終影響神經(jīng)功能的恢復(fù)[2]。NT-3是對SCI功能恢復(fù)作用最強(qiáng)的神經(jīng)營養(yǎng)因子之一,可以促進(jìn)神經(jīng)傳導(dǎo)束的生長和神經(jīng)細(xì)胞功能的恢復(fù),所以,增加損傷局部NT-3的表達(dá)對于治療SCI有著重要意義[3,4]。超聲靶向微泡破裂技術(shù)近年來成為基礎(chǔ)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn),主要機(jī)制是體外目的基因與超聲微泡結(jié)合后導(dǎo)入體內(nèi),再進(jìn)行體外超聲輻照,利用微泡在超聲輻照下產(chǎn)生的空化效應(yīng),在細(xì)胞膜上形成可逆孔隙,從而使目的基因更容易進(jìn)入細(xì)胞,最終達(dá)到靶向治療目的,這種方法具有安全和轉(zhuǎn)染效率高的優(yōu)點(diǎn)[5,6]?；诖?本課題采用超聲微泡靶向介導(dǎo)NT-3治療SCI,期待這種方法可以提高SCI的修復(fù)效果,進(jìn)而為臨床治療SCI提供一種新的可能。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

2月齡雌性SD大鼠40只,清潔級,體質(zhì)量200-220 g。動(dòng)物由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供,生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(陜)11-018。本研究經(jīng)西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 主要試劑與儀器

攜帶NT-3基因的超聲微泡(由西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)骨科提供),NSE抗體(Abcam,美國,貨號(hào)::ab53025),Caspase-3 (Abcam,美國,貨號(hào):ab179517),IL-1β(Sigma,美國,貨號(hào):RAB0277-1KT),IL-6(Abcam公司,美國,貨號(hào):ab222503),倒置相差顯微鏡(Olympus,日本,型號(hào):CKX53);數(shù)碼顯微照相系統(tǒng)(Nikon公司,日本,型號(hào):DS-Ri1-U2)。

1.3 攜帶NT-3超聲微泡的構(gòu)建

將二棕櫚酰磷脂酰甘油(DPPC)5 mg,二硬脂酰磷脂酰膽堿(DSPE)2 mg,pcMV6-NT-3-RFP質(zhì)粒0.4 mg,甘油50 μl,PBS 450 μl加入培養(yǎng)皿中,密閉后置于40 ℃恒溫水浴箱中60 min,注入氧氣及全氟丙烷混合氣體,置于銀汞膠囊調(diào)和器中機(jī)械振動(dòng)2 min,靜置10 min后,加入1.5 ml PBS緩沖液稀釋,即得2 ml攜帶NT-3的脂質(zhì)微泡,低速離心,漂洗3次,即得到純化的脂質(zhì)微泡,輻照滅菌后備用。

1.4 脊髓損傷模型的建立與動(dòng)物分組

隨機(jī)將大鼠隨機(jī)分為4組,每組10只。參照Li等[7]方法制作大鼠SCI打擊模型,參照宋昭君等[8]方法進(jìn)行超聲照射。①對照組打開椎板,未做打擊;②SCI組打擊后不給任何處理;③NT-3微泡組打擊后經(jīng)鼠尾靜脈注射0.5 ml NT-3微泡;④NT-3微泡+超聲照射組打擊后經(jīng)鼠尾靜脈注射0.5 ml NT-3微泡,超聲照射(2.5 W/cm2,5 min),每12 h一次,連續(xù)7 d。

1.5 BBB評分、形態(tài)學(xué)和炎癥介質(zhì)檢測

按照以下步驟進(jìn)行操作:①術(shù)后1 d和7 d對各個(gè)組進(jìn)行BBB評分(n=10),評分越高說明大鼠運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)越好。②術(shù)后7 d,將不同組別大鼠脫頸處死,逐層切開分離組織,脊髓組織以損傷中心取出(n=3),用4%的多聚甲醛固定2 d,梯度脫水后,石蠟包被切片,切片厚度5 μm,進(jìn)行NSE染色和Caspase-3染色,陽性表達(dá)為胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色或褐色顆粒,在低倍鏡(×200)下選取陽性表達(dá)密集區(qū),在高倍鏡(×400)下觀察細(xì)胞形態(tài)、染色定位和程度,采用陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)來評價(jià)其陽性表達(dá),每組取6張切片,隨機(jī)取5個(gè)不同重疊視野進(jìn)行陽性細(xì)胞計(jì)數(shù),并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。③術(shù)后7 d,各組(n=3)大鼠脊髓織取出后用PBS在冰上勻漿,4 ℃,10 000 r/min離心30 min,隨后收集上清液進(jìn)行ELISA。采用ELISA試劑盒來檢測組織中的炎性細(xì)胞因子(IL-1β,IL-6)。

1.6 NT-3mRNA的表達(dá)情況

表1 引物序列

Table 1 Primer sequences

引物上游 下游 β-actin5′-AGATCCTGACCGAGCGTGGC-3′5′-CCAGGGAGGAAGAGGATGCG-3′NT-35′-CGTGGTGGCGAACAGAACAT-3′5′-GGCCGATGACTTGTCGGTC-3′

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,三組或三組以上的比較采用單因素方差分析,其中兩組間比較采用SNK-q檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 BBB評分

術(shù)后1 d和7 d BBB評分SCI組、NT-3微泡組和NT-3微泡+超聲照射組顯著低于對照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。術(shù)后1 d SCI組、NT-3微泡組和NT-3微泡+超聲照射組BBB評分之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;術(shù)后7 d,NT-3微泡+超聲照射組BBB評分顯著增高,與各組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見表2)。

2.2 Caspase-3免疫組織染色

對照組脊髓組織形態(tài)規(guī)則,僅見少量棕褐色的凋亡細(xì)胞,為正常生理現(xiàn)象(見圖1)。其他三組與對照組相比,凋亡細(xì)胞差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。NT-3微泡+超聲照射組凋亡細(xì)胞顯著低于SCI組和NT-3微泡組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見圖1)。

分組1d7d對照組20.17±0.7220.50±0.32SCI組0.92±0.52?1.23±0.48?NT-3微泡組1.11±0.39?1.47±0.43?NT-3微泡+超聲照射組1.01±0.50?5.01±0.21?#△

與對照組比較,*P<0.05;與SCI組相比,#P<0.05;與NT-3組相比,△P<0.05

2.3 NSE免疫組化染色

對照組脊髓組織規(guī)則,可見形態(tài)規(guī)則的神經(jīng)元細(xì)胞,數(shù)量其他三組顯著低于對照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。NT-3微泡+超聲照射組神經(jīng)元數(shù)量顯著高于SCI組和NT-3微泡組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見圖2)。

2.4 炎癥介質(zhì)表達(dá)

相對于對照組,IL-1β和IL-6在SCI組、NT-3微泡組、NT-3微泡+超聲照射組中顯著增高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。SCI組和NT-3微泡組間炎癥介質(zhì)水平無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,但較NT-3微泡+超聲照射組顯著增高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見圖3)。

圖1 超聲微泡靶向介導(dǎo)NT-3對Caspase-3表達(dá)的影響 (×400)

圖2 超聲微泡靶向介導(dǎo)NT-3對各組NSE表達(dá)的影響 (×400)

與對照組比較,*P<0.05;與SCI組相比,#P<0.05;與NT-3組相比,&P<0.05

2.5 NT-3 mRNA表達(dá)

NT-3微泡+超聲照射組NT-3 mRNA表達(dá)顯著高于其他三組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);NT-3微泡組、SCI組與對照組相比,NT-3 mRNA表達(dá)增高,但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(見圖4)。

與對照組比較,*P<0.05;與SCI組相比,#P<0.05;與NT-3組相比,&P<0.05

3 討論

SCI作為一種致殘、致死率極高的疾病,臨床主要采取以下幾個(gè)方式予以治療[9-11]:①手術(shù)解除脊髓壓迫,增加椎體穩(wěn)定性,防止進(jìn)一步損傷;②使用激素和營養(yǎng)神經(jīng)的藥物,抑制局部炎癥反應(yīng)和改善微環(huán)境;③通過針灸、理療等措施促進(jìn)功能恢復(fù)。這些方式對SCI的治療有一定的意義,但離理想中的效果差距甚遠(yuǎn),究其原因在于損傷局部會(huì)出現(xiàn)微環(huán)境紊亂、炎癥細(xì)胞浸潤、神經(jīng)元凋亡、神經(jīng)營養(yǎng)因子缺乏等改變,所以,全面研究SCI的病理改變,解決上述問題,對于提高SCI的治療效果至關(guān)重要。

近年來超聲微泡技術(shù)逐步興起,為治療SCI帶來了新的可能。超聲微泡最初只是被美國FDA批準(zhǔn)的一種超聲造影劑,但隨著研究的深入,越來越多的研究者發(fā)現(xiàn)其在治療疾病中也有著重要作用[12-14]。在超聲波的作用下,微泡中的固定氣體會(huì)發(fā)生壓縮和膨脹從而破裂,進(jìn)而釋放攜帶的藥物或基因,依靠這種機(jī)制超聲微泡可以成為臨床上靶向治療的載體[15]。在中樞系統(tǒng)疾病中,超聲微泡更是具有重要意義,其具備的“聲孔效應(yīng)”,可以導(dǎo)致生物體局部組織的血管壁或一些生物屏障會(huì)暫時(shí)性地產(chǎn)生許多微孔,從而可以促進(jìn)血液和這些局部組織中的物質(zhì)交換,進(jìn)而使得藥物更加容易通過血腦屏障、血脊髓屏障,從而提高治療效果[16,17]。NT-3是神經(jīng)營養(yǎng)素家族中重要的成員,它在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、中樞神經(jīng)元的保護(hù)、周圍神經(jīng)再生等方面發(fā)揮著重要的作用,具有廣泛的生物活性,NT-3與TrkC受體結(jié)合后啟動(dòng)一系列包括TrkA、TrkC和磷脂酶C在內(nèi)的信號(hào)途徑,這些信號(hào)途徑對于神經(jīng)元自身的信號(hào)表達(dá)和功能狀態(tài)具有調(diào)節(jié)作用[18]。將NT-3注射至SCI局部,可以改善微環(huán)境,通過抑制IL-1β和IL-6等炎癥因子表達(dá),調(diào)控炎癥反應(yīng),通過抑制Caspase-3的表達(dá),抑制細(xì)胞凋亡;從而降低神經(jīng)元的死亡,其被證實(shí)對SCI有積極的治療作用,但這種方式由于血脊髓屏蔽的存在,使得NT-3通過率較低且作用時(shí)間較短,無法起到長效作用[19,20]?；诖?本課題將上述兩種措施聯(lián)合使用,即采用超聲微泡靶向介導(dǎo)NT-3治療SCI,期待這種方式可以提高SCI的修復(fù)效果。

本研究中,我們發(fā)現(xiàn)術(shù)后1 d各組間BBB評分無明顯差異,這是由于傷后時(shí)間太短,各種治療措施尚未發(fā)揮作用,所以效果微弱。術(shù)后7 d,與其他三組相比,NT-3微泡+超聲照射組BBB評分顯著增高、細(xì)胞凋亡減少、殘存神經(jīng)元增多,炎癥介質(zhì)表達(dá)降低,NT-3 mRNA表達(dá)升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。這就說明NT-3微泡+超聲照射可以對SCI的治療起到積極意義,分析其可能的原因是:超聲微泡靶向介導(dǎo)NT-3可以增加其在脊髓組織中的表達(dá),從而改善局部微環(huán)境,進(jìn)而在一定程度上抑制局部炎癥介質(zhì)的表達(dá)、減少神經(jīng)元的凋亡和增加殘存神經(jīng)元的數(shù)量,最終為后期功能的恢復(fù)提供基礎(chǔ)。但是我們也發(fā)現(xiàn)NT-3微泡+超聲照射雖然可以提高SCI后大鼠后肢的功能(5.01±0.21),但與對照組(20.50±0.32)差距仍然十分顯著,這就說明這種方式只能微弱地改善大鼠后肢功能,離恢復(fù)還有很長的路要走,另外,本課題只觀察至傷后7 d,時(shí)間較短,遠(yuǎn)期效果有待進(jìn)一步觀察。

綜上所述,本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)超聲微泡靶向介導(dǎo)NT-3對大鼠SCI有著積極的治療作用,這對全面研究SCI的修復(fù)機(jī)制有著重要意義。