陳安忠 耿澤振 李德盛

(1.聊城市第二人民醫(yī)院，山東 聊城 252600；2.中國康復(fù)研究中心運(yùn)動(dòng)療法3科，北京 100068)

骨關(guān)節(jié)炎(Osteoarthritis，OA)是一種嚴(yán)重危害中老年人身心健康的退行性關(guān)節(jié)疾病，其主要病理變化為關(guān)節(jié)軟骨的磨損和退化。OA的臨床表現(xiàn)為關(guān)節(jié)反復(fù)疼痛、關(guān)節(jié)功能障礙等癥狀[1]。關(guān)節(jié)軟骨的主要功能是維持細(xì)胞外基質(zhì)合成和分解代謝平衡，軟骨細(xì)胞凋亡會(huì)打破細(xì)胞外基質(zhì)的代謝動(dòng)態(tài)平衡，進(jìn)而破壞關(guān)節(jié)軟骨結(jié)構(gòu)和功能的完整性，最終導(dǎo)致OA[2]。

低強(qiáng)度脈沖式超聲波(low-intensity pulsed ultrasound，LIPUS)作為新型物理治療方法，具有低成本、高安全性等優(yōu)點(diǎn)，近年來在治療關(guān)節(jié)炎中被廣泛應(yīng)用。研究表明，LIPUS具有促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖、促進(jìn)關(guān)節(jié)軟骨的缺損修復(fù)和軟骨形成等多種作用[3-4]。本實(shí)驗(yàn)擬從體內(nèi)水平研究LIPUS對(duì)OA的保護(hù)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 10周齡SPF級(jí)雄性SD大鼠40只，體質(zhì)量200～220 g，購于北京華阜康生物科技股份有限公司。

1.1.2主要儀器與試劑 低頻聲波治療儀(HT2009-1型)購于日本伊藤公司，TNF-α、IL-1β和IL-6測試盒，購自武漢博士德生物有限公司；β-actin，Bax，Caspase-3和p53抗體購自Abcam公司，二抗購自Santa crus公司。RT-PCR相關(guān)試劑均購于Thermo Fisher公司。

1.2分組與模型建立

1.2.1分組實(shí)驗(yàn) 大鼠在37 ℃恒溫環(huán)境，自然光線下，晝夜12 h：12 h交替飼養(yǎng)，適應(yīng)性喂養(yǎng)一周，過程中對(duì)動(dòng)物的處置嚴(yán)格遵守2006年科學(xué)技術(shù)部發(fā)布的《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見》。利用隨機(jī)數(shù)字表法分為4組，每組10只：假手術(shù)組(Sham組)；模型組(OA組)；30 mW/cm2組；60 mW/cm2組。術(shù)前1 d剔除術(shù)區(qū)毛發(fā)。

1.2.2模型 建立本次實(shí)驗(yàn)構(gòu)建內(nèi)側(cè)半月板撕裂(MMT)模型[5]，2%戊巴比妥鈉(50 mg/kg)腹腔麻醉，待大鼠肌肉松弛提示麻醉成功，將大鼠仰臥固定于手術(shù)臺(tái)。術(shù)區(qū)常規(guī)消毒、鋪單，取大鼠右后肢膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)縱行切口，長約2 cm，逐層切開，暴露內(nèi)側(cè)副韌帶，將其切斷，然后將髕韌帶牽拉至一旁，鑷子牽拉內(nèi)側(cè)半月板找到其與脛骨平臺(tái)相連位置，尖刀半環(huán)狀切斷(避免尖刀損傷脛骨平臺(tái)關(guān)節(jié)面)，鑷子提起半月板暴露其髁間止點(diǎn)，并將其切斷，取出半月板，予以止血，大量生理鹽水沖洗關(guān)節(jié)腔后，逐層縫合，碘伏消毒。術(shù)后預(yù)防性應(yīng)用青霉素3 d。Sham組切開關(guān)節(jié)腔但不切除內(nèi)側(cè)半月板，其余操作相同。LIPUS治療4周后處死大鼠并取右后肢膝關(guān)節(jié)脛骨平臺(tái)，一部分迅速置于-80 ℃冰箱中保存，另一部分固定液經(jīng)固定后，常規(guī)石蠟包埋。

1.2.3LIPUS干預(yù)方法 MMT術(shù)后3 d起，對(duì)大鼠右膝關(guān)節(jié)處施加超聲刺激，將超聲發(fā)生器頭固定于膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)，超聲耦合劑充分結(jié)合，30 mW/cm2組及60 mW/cm2組治療強(qiáng)度分別為30 mW/cm2、60 mW/cm2，其余參數(shù)為FREE模式，通斷比20%，頻率3 MHz，20 min/次，1次/d，共4周。

1.3檢測方法

1.3.1番紅固綠染色10%EDTA處理固定后標(biāo)本3周進(jìn)行脫鈣，常規(guī)酒精脫水、浸蠟、石蠟包埋和切片(厚度4μm)，常規(guī)番紅固綠染色。

1.3.2TUNEL染色石蠟組織切片經(jīng)脫蠟水化處理后，修復(fù)抗原37 ℃與Proteinase K作用，封閉非特異性反應(yīng)加上胎牛血清和小牛血清白蛋白，用PBS漂洗，加入TUNEL緩沖液，PBS漂洗，給予3%甲醇溶液阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，PBS漂洗，再次封閉非特異性抗原加羊血清，PBS漂洗，加1∶2稀釋的POD，PBS漂洗，DAB顯色，蘇木精襯染，通過光學(xué)顯微鏡觀察，細(xì)胞核黃染為陽性著色。

1.3.3生化檢查IL-1β、IL-6、TNF-α檢測。各項(xiàng)指標(biāo)檢測方法嚴(yán)格按試劑盒說明書操作。

1.3.4RT-PCR檢測Bax、Caspase-3、p53表達(dá)水平：RNA提取試劑盒提取組織總RNA，各組取等量RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，通過PCR擴(kuò)增Bax、Caspase-3及內(nèi)參β-actin的cDNA。每個(gè)檢測點(diǎn)設(shè)3個(gè)平行反應(yīng)管，以cDNA為模板對(duì)Bax、Caspase-3基因進(jìn)行定量PCR擴(kuò)增。引物序列如下：Bax，正義5’-GGTTGCCCTCTTGTACTTGC-3’,反義5’-TCTTCCAGATGGTGAGCGAG-3’；Caspase-3，正義5’-ATGGAGAACAACAAAACCTCAGT -3’,反義5’-TTGCTCCCATGTATGGTCTTTAC -3’；p53，正義5’-TTGCCGTCCCAAGCAATGGATGA-3’,反義5’-TCTGGGAAGGGACAGAAGATGAC-3’；β-actin，正義5’-CCCGCCGCCAGCTCACCATGG -3’,反義5’-AAGGTCTCAAACATGATCTGGGTC -3’。根據(jù)各反應(yīng)管的靶基因循環(huán)閾值(Ct)和內(nèi)參基因Ct值，采用比較Ct值法(2-ΔΔCt)計(jì)算Bax、Caspase-3、p53水平。

1.3.5免疫組化檢測 Bax、Caspase-3表達(dá)水平石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，抗原修復(fù)，血清封閉，滴加一抗，4℃冰箱過夜，滴加二抗，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，蘇木素復(fù)染，脫水，透明，封片。陽性判定標(biāo)準(zhǔn)：以被染成棕褐色為陽性結(jié)果。

1.3.6Western blot法檢測 p53蛋白表達(dá)組織蛋白的提?。簩?biāo)本儲(chǔ)存于-80℃低溫冰箱中，提取蛋白時(shí)取出標(biāo)本稱重，每100 mg組織加入1 mL RIPA，加入10 μL PMSF，組織勻漿，低溫離心15 min，10 000～14 000 r/min，取上清加入5×蛋白上樣buffer，煮沸5 min分裝，-70 ℃保存，現(xiàn)用現(xiàn)取。提取蛋白后灌膠上樣，加樣后先用恒流(10mA)，再用恒壓(100V)電泳至溴酚藍(lán)到凝膠底部。待電泳停止后，將凝膠轉(zhuǎn)移PVDF膜上，轉(zhuǎn)移電壓為100 V，時(shí)間120 min。然后將PVDF膜移至含有封閉液的平皿中，室溫下?lián)u床上搖動(dòng)封閉2h。取出PVDF膜，加入稀釋后的一抗(1∶1 000)冰箱里4 ℃過夜。再用TBST室溫下脫色搖床上洗3次，每次10 min。然后加入1∶1 000稀釋的辣根酶標(biāo)記羊抗兔IgG抗體室溫孵育1 h，用TBST室溫下脫色搖床上洗5次，每次10 min。將顯色劑滴加于晾干的PVDF膜上，顯色照相。最后用quantity one軟件對(duì)條帶進(jìn)行分析。

2 結(jié) 果

2.1LIPUS對(duì)IL-1β、IL-6、TNF-α的影響 與Sham組比較，OA組TNF-α、IL-1β和IL-6含量均增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與OA組比較，LIPUS組(30mW/cm2組和60mW/cm2組)TNF-α、IL-1β和IL-6含量降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與30mW/cm2組比較，60mW/cm2組中TNF-α、IL-1β和IL-6含量降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 大鼠軟骨組織中TNF-α、IL-1β和IL-6的比較

注：與Sham組比較aP<0.05；與OA組比較bP<0.05；與30 mW/cm2組比較cP<0.05。

2.2各組大鼠關(guān)節(jié)軟骨結(jié)構(gòu)的比較 番紅固綠染色結(jié)果：Sham組大鼠關(guān)節(jié)面光滑，細(xì)胞排列整齊有序，未見細(xì)胞基質(zhì)溶解；OA組大鼠關(guān)節(jié)面潰瘍形成，軟骨面嚴(yán)重剝脫，表淺軟骨細(xì)胞嚴(yán)重缺失；30 mW/cm2組大鼠關(guān)節(jié)面較深裂隙形成，可見潰瘍或少量軟骨面剝脫，表淺軟骨細(xì)胞部分缺失；60 mW/cm2組大鼠軟骨細(xì)胞排列略紊亂，無明顯關(guān)節(jié)面潰瘍形成，軟骨面輕微剝脫，表淺軟骨細(xì)胞輕微缺失。見圖1。

圖1 各組大鼠關(guān)節(jié)軟骨結(jié)構(gòu)比較

2.3各組大鼠關(guān)節(jié)軟骨凋亡細(xì)胞數(shù)比較 TUNEL法鏡下顯示Sham組可見極少量軟骨細(xì)胞凋亡，散布在軟骨表層；OA組可見大量陽性的凋亡細(xì)胞，呈片狀分布；30 mW/cm2組可見的凋亡細(xì)胞數(shù)量明顯少于OA組，但多于Sham組，不均勻分布于軟骨組織中；60 mW/cm2組與Sham組比較，凋亡細(xì)胞數(shù)量增加，與OA組比較凋亡細(xì)胞數(shù)量明顯減少，與30 mW/cm2組比較，凋亡細(xì)胞數(shù)量明顯減少，部分凋亡細(xì)胞核破裂，核仁染成棕黃色。見圖2。

圖2 各組大鼠TUNEL結(jié)果比較

2.4RT-PCR及免疫組化檢測 Bax、Caspase-3表達(dá)水平與Sham組比較，OA組大鼠的Bax、Caspase-3表達(dá)增高；與OA組比較，30 mW/cm2組和60 mW/cm2組大鼠的Bax、Caspase-3表達(dá)降低；與30 mW/cm2組比較，60 mW/cm2組大鼠Bax、Caspase-3表達(dá)降低。見圖3。

注：與Sham組比較＊P<0.05；與OA組比較#P<0.05；與30mW/cm2組比較▲P<0.05。圖3 Bax、Caspase-3表達(dá)情況

2.5各組大鼠關(guān)節(jié)軟骨中p53蛋白表達(dá)測定 Western blot法蛋白含量檢測顯示，與Sham組比較，OA組p53蛋白表達(dá)均顯著升高(P<0.05)；與OA組比較，LIPUS組(30 mW/cm2組和60 mW/cm2組)p53蛋白表達(dá)降低(P<0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與30 mW/cm2組比較，60 mW/cm2組中p53蛋白表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖4。

圖4 各組大鼠關(guān)節(jié)軟骨中p53表達(dá)比較

3 討 論

骨關(guān)節(jié)炎主要病理特征是關(guān)節(jié)軟骨退化和軟骨細(xì)胞外基質(zhì)破壞[6]，軟骨細(xì)胞外基質(zhì)主要由軟骨細(xì)胞分泌[7]。研究[8]表明，OA中軟骨細(xì)胞丟失率高達(dá)20%，這表明軟骨細(xì)胞在維持細(xì)胞外代謝機(jī)制中起著重要作用，其凋亡會(huì)導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨退化。LIPUS能通過增強(qiáng)軟骨周圍基質(zhì)黏附，激活細(xì)胞骨架形成，促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖[9]。軟骨組織中一些敏感性較高的酶，如膠原酶，能對(duì)LIPUS的熱效應(yīng)做出反應(yīng)，促進(jìn)軟骨細(xì)胞代謝，抑制軟骨細(xì)胞凋亡[10]。此外，LIPUS能夠促進(jìn)血液與關(guān)節(jié)滑液之間的小分子物質(zhì)交換，改善關(guān)節(jié)軟骨營養(yǎng)[11]。

IL-1β、IL-6和TNF-α是體內(nèi)重要的細(xì)胞因子。研究表明，細(xì)胞凋亡是由同源的IL-1β轉(zhuǎn)化酶蛋白酶家族激活引起的。一方面，它將新合成的IL-1β前體轉(zhuǎn)化為活性的IL-1β[12]；另一方面，它導(dǎo)致維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的基質(zhì)蛋白分解，通過激活家族其他成員介導(dǎo)細(xì)胞凋亡[13]。IL-6影響多種細(xì)胞的生長、分化和基因表達(dá)。其表達(dá)異常與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)[14]。TNF-α具有很強(qiáng)的促凋亡作用[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，與Sham組比較，OA組大鼠軟骨組織中IL-1β、IL-6和TNF-α顯著升高；與OA組比較，30 mW/cm2及60 mW/cm2組大鼠軟骨組織中IL-1β、IL-6和TNF-α顯著降低；與30 mW/cm2組比較，60 mW/cm2組大鼠軟骨組織中IL-1β、IL-6和TNF-α亦明顯降低，表明LIPUS干預(yù)后，可減少軟骨組織中促凋亡細(xì)胞因子，且60 mW/cm2效果優(yōu)于30 mW/cm2。番紅固綠及TUNEL染色結(jié)果表明，與OA組相比，30 mW/cm2及60 mW/cm2組關(guān)節(jié)軟骨損傷程度明顯減輕，細(xì)胞基質(zhì)溶解及軟骨面剝脫程度減輕，軟骨細(xì)胞缺失減少，60 mW/cm2組較30 mW/cm2組損傷程度更輕。由此可見，LIPUS能通過抑制促凋亡細(xì)胞因子，減輕軟骨細(xì)胞損傷及凋亡。

Bax是Bcl-2家族促凋亡的成員之一，Bax表達(dá)上調(diào)促進(jìn)細(xì)胞凋亡[16]。另外，Caspase-3是一種定位于細(xì)胞質(zhì)的非活性酶原，其能匯聚多種凋亡刺激信號(hào)。Caspase-3激活會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞固縮、染色質(zhì)凝聚和DNA斷裂，進(jìn)而細(xì)胞發(fā)生不可逆轉(zhuǎn)的凋亡[17]。RT-PCR及免疫組化結(jié)果可見，與Sham組比較，OA組大鼠的Bax、Caspase-3表達(dá)增高；與OA組比較，30 mW/cm2組及60 mW/cm2組大鼠軟骨組織中Bax、Caspase-3表達(dá)降低；與30 mW/cm2組比較，60 mW/cm2組大鼠的Bax、Caspase-3表達(dá)更低。這提示LIPUS可通過調(diào)控凋亡基因表達(dá)，從而減輕OA中關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡。

細(xì)胞凋亡是一種基于遺傳機(jī)制的細(xì)胞死亡形式，其誘導(dǎo)了一系列重要的病理生理變化[18]。p53是公認(rèn)的凋亡基因，在細(xì)胞凋亡中起著重要作用。p53調(diào)控細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制主要為兩方面：抑制細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[19]。RT-PCR及western-blot結(jié)果可見，與Sham組比較，OA組大鼠的p53表達(dá)增高；與OA組比較，30 mW/cm2及60 mW/cm2組大鼠軟骨組織中p53表達(dá)降低；與30 mW/cm2組比較，60 mW/cm2組大鼠的p53表達(dá)更低。這提示LIPUS可通過調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，減輕OA中關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)從體內(nèi)水平研究LIPUS對(duì)OA的保護(hù)機(jī)制，發(fā)現(xiàn)LIPUS可通過抑制促凋亡細(xì)胞因子、調(diào)控凋亡基因表達(dá)及相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等機(jī)制減輕OA中軟骨細(xì)胞凋亡，這為臨床使用LIPUS治療OA提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。