王世君 彭曉楓 張梅

(1.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院臨檢科，貴州 貴陽 550004；2.貴州醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院，貴州 貴陽 550004)

正常精液在凝固和液化因子共同作用下，先凝固并在短時(shí)間內(nèi)液化，這種協(xié)調(diào)關(guān)系被打破，就會(huì)發(fā)生精液不液化或液化不全。有學(xué)者[1-9]對不液化精液經(jīng)酶處理后的精子活力和活率等進(jìn)行了研究，但酶對精子形態(tài)學(xué)的影響研究較少,故本文選用胰蛋白酶、糜蛋白酶、透明質(zhì)酸酶、菠蘿蛋白酶處理液化異常精液，觀察精液液化情況、記錄液化時(shí)間，通過觀察精子形態(tài)變化及各部位畸形率的變化，探索四種酶對精子形態(tài)學(xué)的影響。

1 材料與方法

1.1一般資料 取自2018年3至4月期間在我院臨檢科行精液常規(guī)檢查的男性，對受檢者進(jìn)行病史詢問和問卷調(diào)查(包括近三年有無生育史，有無性功能障礙史，有無發(fā)現(xiàn)生殖系統(tǒng)明顯異常)。要求受檢者禁欲3～7 d，手淫法將一次性排出的全部精液收集在量杯內(nèi)。胰蛋白酶購自上海雅新生物技術(shù)有限公司、糜蛋白酶購自上海醫(yī)藥生物技術(shù)有限公司、透明質(zhì)酸酶購自美國sigma公司、菠蘿蛋白酶購自上海鼓臣生物有限公司、瑞氏試劑購自深圳華康生物醫(yī)學(xué)工程有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)分組 將每例標(biāo)本分別取原精液0.5 mL置于5支試管中并編號。對照組：不加任何處理因素；胰蛋白酶組：加入4 000 IU/mL的胰蛋白酶0.5 mL；糜蛋白酶組：加入2 000 IU/mL的糜蛋白酶0.5 mL；透明質(zhì)酸酶組：加入6 000 IU/mL透明質(zhì)酸酶0.5 mL；菠蘿蛋白酶組：加入150 U/mL的菠蘿蛋白酶0.5 mL[10]。

1.3液化情況及時(shí)間觀察 37 ℃溫箱溫育，每5～10 min觀察液化情況：輕輕搖動(dòng)試管，以精液中有不液化凝塊或黏液絲為不液化的征象，記錄凝塊和黏液絲消失的時(shí)間。若精液超過60 min仍未完全液化，加入同等份量的酶，繼續(xù)觀察并記錄液化時(shí)間。篩出精液液化正常及異常標(biāo)本各30例。

1.4制片及染色 取一滴完全液化精液滴在載玻片的一端，用推片以“一字型”方式向另一端移動(dòng)涂抹均勻，自然風(fēng)干，行瑞氏染色。

1.5精子形態(tài)學(xué)觀察及畸形率測定 選擇兩名有經(jīng)驗(yàn)的工作人員采用雙盲法，選取精液涂片較好的視野觀察精子形態(tài)，評估視野中的每一條精子，每份標(biāo)本重復(fù)觀察評估至少200個(gè)精子。按照第五版《世界衛(wèi)生組織人類精液檢查與處理實(shí)驗(yàn)室手冊》[11]所規(guī)定的方法，分別記錄頭部、頸部和中段、主段的畸形率。

2 結(jié) 果

2.1液化時(shí)間 液化正常精液加入四種酶后，與對照組比較，各酶處理組液化時(shí)間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。液化異常精液中加入四種酶后，與對照組比較，各酶處理組液化時(shí)間顯著縮短，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見表1。

表1 精液液化時(shí)間加酶后的變化

注：與對照組比較，*P<0.01。

2.2液化正常精液加酶前后精子形態(tài)的改變 與對照組比較，胰蛋白酶組頭部、主段畸形率明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，其中出現(xiàn)大頭、小頭、錐形頭、梨形頭的精子；透明質(zhì)酸酶組頸部和中段、主段畸形率明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，頸部和中段出現(xiàn)粗或不規(guī)則，主段出現(xiàn)斷裂，成角彎曲，卷曲等；其余各酶處理組各部畸形率差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 液化正常精液組加酶后精子形態(tài)畸形率的比較

注：與對照組比較，*P<0.01。

2.3液化異常精液加酶前后精子形態(tài)的改變 與液化異常對照組比較，胰蛋白酶組僅主段畸形率明顯升高，出現(xiàn)斷裂，成角彎曲，卷曲等，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；透明質(zhì)酸酶組頸部和中段畸形率、主段畸形率明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，頸部和中段出現(xiàn)粗或不規(guī)則，主段出現(xiàn)斷裂，成角彎曲，卷曲等；其余各酶處理組各部畸形率差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表3 加酶前后液化異常組精子形態(tài)畸形率的比較

注：與對照組比較，*P<0.01。

3 討 論

在酶的共同作用下精液發(fā)生液化,若某些酶的活性減低或缺少,使液化因子與凝固因子間的平衡被打破,精液表現(xiàn)為液化異常[12-13]。胰蛋白酶、糜蛋白酶、透明質(zhì)酸酶、菠蘿蛋白酶均可以縮短本身液化異常精液的液化時(shí)間，而對本身液化正常的精液的液化時(shí)間沒有明顯影響。

異常液化精液加酶后粘稠度下降，凝集減少，取樣容易。對精子進(jìn)行染色，精子分布均勻，著色較好，頂體區(qū)和頭區(qū)分明，易于形態(tài)觀察。正常或異常液化精液加入胰蛋白酶后，明顯影響精子頭部或主段。胰蛋白酶是肽鏈內(nèi)切酶，可能通過精囊凝固蛋白途徑或纖溶途徑來影響精液液化時(shí)間，其具體機(jī)制有待于進(jìn)一步的研究。加入透明質(zhì)酸酶后精子頸部和中段、主段畸形率明顯升高，頸部和中段出現(xiàn)粗或不規(guī)則，主段出現(xiàn)斷裂，成角彎曲，卷曲等。透明質(zhì)酸酶可以水解透明質(zhì)酸，而透明質(zhì)酸可與蛋白結(jié)合影響體液粘度，透明質(zhì)酸酶在精液中是否通過水解透明質(zhì)酸加快液化時(shí)間，仍需要實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)。胰蛋白酶和透明質(zhì)酸酶可能對精子本身的結(jié)構(gòu),特別是精子的膜結(jié)構(gòu)有一定的損傷作用，可能使精子頭部，頸部和中段，主段中的某些酶或蛋白發(fā)生改變，從而使精子膜結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，導(dǎo)致精子形態(tài)發(fā)生改變，使畸形率增加。這兩種酶對精子形態(tài)影響的機(jī)制仍需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究。糜蛋白酶和菠蘿蛋白酶在縮短液化異常精液的液化時(shí)間的同時(shí)，對精子的形態(tài)無明顯影響。糜蛋白酶能迅速分解變性蛋白質(zhì)，作用、用途與胰蛋白酶相似，只是水解位點(diǎn)不同，比胰蛋白酶分解能力強(qiáng)、毒性低、不良反應(yīng)小，其縮短精液液化時(shí)間的機(jī)制可能與胰蛋白酶相同。菠蘿蛋白酶可能是通過分解纖維蛋白來縮短精液液化時(shí)間。

綜上所述，在臨床工作中，為使液化異常精液分析更具有診斷價(jià)值，能為臨床提供準(zhǔn)確的分析結(jié)果，可通過加入糜蛋白酶或菠蘿蛋白酶來縮短精液液化時(shí)間，改善液化情況，進(jìn)一步提高精子形態(tài)學(xué)分析的可靠性。