林啟凰，林聰煒，張 娜，紀美茹，陳仲巍，張 崗*

(1.廈門醫(yī)學院藥學系，福建 廈門 361000；2.廈門弘愛醫(yī)院，福建 廈門 361000)

炮仗花(Pyrostegiavenusta(Ker Gawl.))，別名黃鱔藤，為紫葳科炮仗藤屬藤本植物，廣泛分布于我國的華南和西南地區(qū)[1]，常用于庭院垂直綠化[2]。在民間，炮仗花的葉子和花被用于治療白斑病[3]，并用于防治支氣管炎、肺結(jié)核、咳嗽、流感等呼吸系統(tǒng)感染[4-5]。研究[6-7]證明，炮仗花提取物具有抗氧化、抗菌和愈合傷口等活性。化學成分研究表明，炮仗花橙色素主要組成為胡蘿卜素、葉黃素等類胡蘿卜素類物質(zhì)[8]，是其花瓣呈橙紅色的主要色素。

類胡蘿卜素是由8個異戊二烯單元構(gòu)成的長鏈萜烯化合物[9]，是公認的安全性食品補充劑和食用色素，對癌癥、心血管病等疾病具有干預治療作用[10]。由于長共軛體系的存在，大多數(shù)類胡蘿卜素的紫外光譜在400～500 nm間有最大吸收峰[11]；而在此波長范圍內(nèi)，植物中的其它成分幾乎無吸收峰。因此，可以采用分光光度法測定植物中類胡蘿卜素含量[12]。目前，國內(nèi)未有炮仗花類胡蘿卜素含量測定的相關(guān)報道。鑒于此，作者采用超聲波輔助法提取炮仗花類胡蘿卜素，采用分光光度法測定其含量，通過紅外光譜對其結(jié)構(gòu)進行表征，并利用脂多糖(LPS)誘導的小鼠巨噬細胞(RAW264.7)炎癥模型評價其抗炎活性，以期對炮仗花色素的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 實驗

1.1 材料、試劑與儀器

炮仗花，于2019年3月采自福建省廈門市，經(jīng)鑒定為紫葳科炮仗藤屬植物炮仗花(Pyrostegiavenusta(Ker Gawl.))的花。

無水乙醇(分析純)，國藥集團化學試劑有限公司；2,6-二叔丁基-4-甲氧基苯酚(BHT)(分析純)，西格瑪奧德里奇貿(mào)易有限公司；β-胡蘿卜素對照品(批號：H-02-180914)，成都瑞芬思生物科技有限公司。

Alpha型紅外分光光度計，德國布魯克；Shimadzu UV-1800型紫外分光光度計，日本島津公司；PA225D型十萬分之一分析天平,賽多利斯；N-2100X型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，日本Eyela公司；DHG-9140型鼓風干燥箱，上海一恒有限公司；KQ-300DE型超聲波清洗儀，昆山超聲儀器有限公司；Tecan Infinite M1000 PRO型酶聯(lián)免疫檢測儀,Tecan公司。

1.2 方法

1.2.1 對照溶液的配制

精密稱取β-胡蘿卜素對照品4.98 mg，用無水乙醇(含0.01%BHT，下同)溶解并定容至50 mL棕色容量瓶中，配制成母液。精密移取母液5 mL，用無水乙醇稀釋并定容至50 mL容量瓶中，作為儲備液，備用。

1.2.2 供試溶液的制備

60 ℃烘干的炮仗花用粉碎機粉碎，過4號篩，備用。精密稱取炮仗花粉末10 mg，置于100 mL棕色具塞三角燒瓶中，精密加入無水乙醇20 mL，稱重，超聲波(功率500 W)輔助提取20 min，放冷，再稱重，用無水乙醇補足，過濾，取續(xù)濾液用于分析。

1.2.3 檢測波長的確定

分別取β-胡蘿卜素對照品和炮仗花提取物適量，加入適量無水乙醇，超聲提取，過濾，濾液進行全波長紫外可見吸收光譜掃描，掃描范圍200～600 nm。

1.2.4 標準曲線的繪制

分別精密量取β-胡蘿卜素對照儲備液1.0 mL、1.5 mL、2.0 mL、2.5 mL、3.0 mL、3.5 mL，置于10 mL 棕色容量瓶中，用無水乙醇定容，搖勻；以無水乙醇為空白溶液，于450 nm處測定吸光度。以β-胡蘿卜素濃度(x,μg·mL-1) 為橫坐標、吸光度(y)為縱坐標，繪制標準曲線。

1.2.5 炮仗花類胡蘿卜素的結(jié)構(gòu)表征

取炮仗花粉末適量，置于100 mL棕色具塞三角燒瓶中，加入適量無水乙醇超聲波(功率500 W)輔助提取20 min，過濾；濾液低溫蒸干，加入適量水混懸，用正己烷萃取3次，合并萃取液；無水Na2SO4干燥后，低溫蒸干，得紅棕色炮仗花提取物。檢測前將提取物置于干燥器內(nèi)干燥過夜，紅外燈下以KBr壓片，測定紅外光譜。

1.2.6 抗炎活性評價

1.2.6.1 炮仗花提取物的制備

精密稱取炮仗花粉末0.501 2 g，加入20 mL無水乙醇，超聲波輔助提取20 min，過濾，濾液濃縮蒸干成浸膏，備用。

1.2.6.2 炮仗花提取物中類胡蘿卜素含量的測定

精密稱取炮仗花提取物15.51 mg，用無水乙醇溶解并定容至100 mL容量瓶中，于450 nm處測定其吸光度。

1.2.6.3 細胞毒性實驗[13]

向含有一定濃度的小牛血清、青霉素以及鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)入事先復蘇的RAW264.7細胞，在CO2培養(yǎng)箱中37 ℃下培養(yǎng)細胞至對數(shù)期，以EDTA-2Na和胰酶作為消化液進行消化。將以上處理好的細胞懸浮液加入不同濃度的炮仗花提取物溶液，繼續(xù)培養(yǎng)過夜，加入MTT溶液及DMSO，搖床振蕩。采用酶聯(lián)免疫檢測儀于450 nm處測定吸光度，并根據(jù)下式計算細胞存活率：

細胞存活率=A樣品/A空白×100%

1.2.6.4 NO抑制實驗

采用Griess法[14]檢測炮仗花提取物的NO含量。按1.2.6.3方法培養(yǎng)RAW264.7細胞，每孔加入不同濃度的炮仗花提取物溶液孵育1 h，加入1 μg·mL-1LPS溶液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，收集細胞上清液，并按照NO試劑盒操作說明測定NO含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 檢測波長的確定

β-胡蘿卜素對照品和炮仗花提取物的紫外可見吸收光譜見圖1。

從圖1可以看出，β-胡蘿卜素對照品和炮仗花提取物均在450 nm處有最大吸收。因此，選擇450 nm作為檢測波長。

圖1 β-胡蘿卜素對照品(a)和炮仗花提取物(b)的紫外可見吸收光譜Fig.1 UV-Vis absorption spectra of β-carotene reference substance(a) and Pyrostegia venusta extract(b)

2.2 炮仗花類胡蘿卜素的結(jié)構(gòu)表征

炮仗花提取物的紅外光譜見圖2。

從圖2可以看出，炮仗花提取物在3 375 cm-1附近顯示了強且寬的吸收帶，為典型的-OH伸縮振動信號；3 010 cm-1處為烯烴=CH伸縮振動峰；1 641 cm-1、1 631 cm-1、1 612 cm-1處為共軛多烯中C=C伸縮振動峰；1 061 cm-1處為=CH面外彎曲振動峰，說明分子中含有共軛多烯結(jié)構(gòu)；2 925 cm-1、2 854 cm-1處為-CH3、-CH2伸縮振動峰；1 462 cm-1、1 444 cm-1處為-CH3、-CH2面內(nèi)彎曲振動信號。以上信息與類胡蘿卜素結(jié)構(gòu)相符[15-16]。此外，炮仗花提取物在1 738 cm-1、1 727 cm-1附近顯示了C=O特征伸縮振動吸收峰，在1 260 cm-1、1 154 cm-1附近顯示了C-O伸縮振動吸收峰，吸收強度均為中等，說明炮仗花提取物中部分化合物含有羰基或酯鍵官能團，炮仗花中類胡蘿卜素極性較大。

2.3 提取方法的優(yōu)化

2.3.1 提取溶劑

精密稱取炮仗花粉末10 mg，共7份，分別加入無水乙醇、甲醇、氯仿、乙酸乙酯、石油醚(60～90 ℃)、丙酮和正己烷各20 mL，超聲輔助提取30 min，450 nm處測定其吸光度，考察提取溶劑對炮仗花類胡蘿卜素提取率的影響，結(jié)果見圖3。

圖3 提取溶劑對提取率的影響Fig.3 Effect of extraction solvent on extraction rate

從圖3可以看出，以無水乙醇為提取溶劑時，吸光度最大。故確定提取溶劑為無水乙醇。

2.3.2 提取溶劑用量

精密稱取炮仗花粉末10 mg，共6份，分別加入無水乙醇5 mL、10 mL、15 mL、20 mL、25 mL、30 mL，超聲輔助提取30 min，450 nm處測定其吸光度,考察提取溶劑用量對炮仗花類胡蘿卜素提取率的影響，結(jié)果見圖4。

圖4 提取溶劑用量對提取率的影響Fig.4 Effect of extraction solvent dosage on extraction rate

從圖4可以看出，隨著提取溶劑用量的增加，類胡蘿卜素提取率逐漸升高，當無水乙醇用量為20 mL時，提取率最高；之后隨著提取溶劑用量繼續(xù)增加，提取率趨于穩(wěn)定。故確定無水乙醇用量為20 mL。

2.3.3 提取時間

精密稱取炮仗花粉末10 mg，共9份，加入等量無水乙醇溶液，超聲輔助提取時間分別為5 min、10 min、15 min、20 min、25 min、30 min、40 min、50 min、60 min，450 nm處測定其吸光度，考察提取時間對炮仗花類胡蘿卜素提取率的影響，結(jié)果見圖5。

圖5 提取時間對提取率的影響Fig.5 Effect of extraction time on extraction rate

從圖5可以看出，隨著提取時間的延長，類胡蘿卜素提取率先升高后降低，20 min時達到最高。故確定提取時間為20 min。

2.4 β-胡蘿卜素的標準曲線(圖6)

根據(jù)β-胡蘿卜素對照品濃度(x，μg·mL-1)和相應(yīng)的吸光度(y)繪制標準曲線，擬合得β-胡蘿卜素線性回歸方程為y=0.1461x-0.0207(R2=0.9999)，β-胡蘿卜素濃度在0.996～3.486 μg·mL-1范圍內(nèi)與吸光度具有良好線性關(guān)系。

圖6 β-胡蘿卜素標準曲線Fig.6 Standard curve of β-carotene

2.5 方法學考察

2.5.1 精密度實驗

精密移取同一β-胡蘿卜素對照溶液6份，于450 nm處測定吸光度。測得6份對照溶液吸光度的RSD為0.19%，表明紫外分光光度計的精密度良好。

2.5.2 穩(wěn)定性實驗

精密稱取炮仗花粉末約10 mg，制備供試溶液，分別在0 min、5 min、10 min、20 min、30 min、40 min、50 min、60 min于450 nm處測定吸光度。測得60 min內(nèi)RSD 為0.59%，表明炮仗花類胡蘿卜素在60 min內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5.3 重復性實驗

精密稱取炮仗花粉末6份，每份約10 mg，制備供試溶液，于450 nm處測定吸光度。測得吸光度的RSD為0.74%(n=6)，表明該方法重復性良好。

2.5.4 加樣回收率實驗

精密稱取炮仗花粉末9份，每份約10 mg，分別置于100 mL 棕色具塞三角燒瓶中，分為3組，每份樣品中精密加入一定量β-胡蘿卜素對照品，制備供試品溶液，在450 nm處測定吸光度，計算加樣回收率，結(jié)果見表1。

從表1可以看出，平均加樣回收率為100.08%，RSD為1.46%，表明該方法準確度良好。

2.6 含量測定

精密稱定炮仗花粉末約10 mg，共3 份，制備供試溶液，450 nm處測定吸光度，計算炮仗花類胡蘿卜素含量，結(jié)果見表 2。

表1 加樣回收率結(jié)果(n=9)

Tab.1 Results of adding standard recovery(n=9)

表2 含量測定結(jié)果(n=3)

Tab.2 Determination results of content

從表2可以看出，炮仗花類胡蘿卜素平均含量為31.77 μg·mg-1，RSD為0.66%。

2.7 抗炎活性研究

炮仗花類胡蘿卜素的抗炎活性見圖7。

從圖7a可以看出，炮仗花提取物在10～200 μg·mL-1范圍內(nèi)顯示出弱細胞毒性，濃度為50 μg·mL-1時，細胞存活率最低；之后隨著濃度增加，細胞存活率略微升高。從圖7 b可以看出，LPS組NO含量遠高于空白對照組(P<0.001)，提示抗炎模型構(gòu)建成功；用炮仗花提取物預處理RAW264.7巨噬細胞后，LPS誘導產(chǎn)生NO受到抑制，其抑制能力呈劑量依賴性。以上結(jié)果表明，炮仗花提取物具有一定的抗炎活性，有關(guān)其抗炎機理及活性成分組成，有待于進一步研究。

**:P<0.01,與LPS處理組比較;***:P<0.001,與LPS處理組比較

2.8 討論

2.8.1 影響因素

類胡蘿卜素易氧化降解，并光、熱、酸敏感，容易變質(zhì)。在實驗過程中，提取溶劑中加入少量BHT可延緩類胡蘿卜素氧化降解。同時，應(yīng)避光、低溫操作，以減少實驗誤差。

2.8.2 類胡蘿卜素含量測定

含量測定結(jié)果顯示，炮仗花類胡蘿卜素含量為31.77 μg·mg-1，說明炮仗花中含有一定量的類胡蘿卜素，可以作為天然類胡蘿卜素資源加以開發(fā)利用。另外分光光度法測定炮仗花類胡蘿卜素含量操作簡便、準確度高、重復性好，可以作為評價炮仗花橙色素質(zhì)量的檢測方法。

2.8.2 炮仗花干燥溫度的考察

考察了冷凍干燥和烘干兩種方式，以及烘干溫度(40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃、100 ℃)對炮仗花中類胡蘿卜素含量的影響。結(jié)果表明，60 ℃烘干得到的炮仗花樣品測得的類胡蘿卜素含量最高。冷凍干燥法所得樣品為鮮艷的橙黃色，但在保存條件下會慢慢退去，推測可能發(fā)生酶解反應(yīng)，使得其內(nèi)色素發(fā)生降解。

3 結(jié)論

采用超聲波輔助法提取炮仗花類胡蘿卜素，采用分光光度法測定炮仗花類胡蘿卜素含量，并通過紅外光譜對炮仗花類胡蘿卜素結(jié)構(gòu)進行表征。利用脂多糖(LPS)誘導的小鼠巨噬細胞(RAW264.7)炎癥模型評價提取物抗炎活性。結(jié)果表明，最佳提取方法為：以20 mL無水乙醇為提取溶劑，超聲波輔助提取20 min。β-胡蘿卜素濃度(x)在0.996～3.486 μg·mL-1范圍內(nèi)與吸光度(y)線性關(guān)系良好，其線性回歸方程為y=0.1461x-0.0207，R2=0.9999(n=6)，精密度RSD為0.19%，穩(wěn)定性RSD為0.59%，重復性RSD為0.74%，平均加樣回收率為100.08%，RSD為1.46%(n=9)，測得炮仗花類胡蘿卜素含量為31.77 μg·mg-1。抗炎活性實驗表明，炮仗花類胡蘿卜素在高濃度時呈一定細胞毒性，且濃度依賴性抑制NO生成，具有一定的抗炎活性。