程 浩，王曉麗，董小婧，周志文

(江蘇省腫瘤醫(yī)院，江蘇省腫瘤防治研究所，南京醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院，江蘇 南京 210009)

杜仲(EucommiaulmoidesOliv.)為杜仲科杜仲屬僅存的孑遺植物，是我國國家二類保護植物[1]。杜仲是傳統(tǒng)中藥材，《神農(nóng)本草經(jīng)》記載“主治腰膝痛，補中，益精氣，堅筋骨，除陰下癢濕，小便余瀝。久服，輕身耐老?！盵2]杜仲中含有幾十種藥理活性物質(zhì)，主要有木質(zhì)素類、苯丙素類、環(huán)烯醚萜類以及其它萜類化合物等[3-5]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，杜仲在降低血壓方面有很好的療效，進一步研究證實杜仲中木脂素類化合物松脂醇二葡萄糖苷(PDG)是降壓的主要成分[6-8]。杜仲既可以使高血壓病人血壓降低又可以使低血壓病人血壓上升，并且調(diào)節(jié)血壓持久無任何其它不利影響[9]。杜仲資源珍貴稀少，生長緩慢，僅僅依靠提取手段很難滿足日益增長的市場需要[10-11]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，寄生于植物體內(nèi)的內(nèi)生真菌和寄主植物協(xié)同進化，內(nèi)生真菌可以在生命活動過程中合成某些藥用植物所具有的相同或相似的物質(zhì)[12-13]。本課題組從徐州市選取10年樹齡的杜仲樹樹皮，分離出能產(chǎn)生PDG的內(nèi)生真菌8株，通過篩選獲得一株產(chǎn)量較高的擬莖點霉屬內(nèi)生真菌SX2018-06，PDG產(chǎn)量可達18.63 mg·L-1。

作者以擬莖點霉屬SX2018-06為研究對象，進行發(fā)酵工藝條件優(yōu)化，以提高PDG產(chǎn)量，為工業(yè)化生產(chǎn)PDG提供理論和實踐基礎(chǔ)。

1 實驗

1.1 菌種、試劑與培養(yǎng)基

1.1.1 菌種

擬莖點霉屬(Phomopsissp.)SX2018-06，實驗室保藏菌種。

1.1.2 試劑

可溶性淀粉，天津鼎盛鑫化工有限公司；玉米漿，安琪酵母股份有限公司；葡萄糖、麥芽糖、乳糖，分析純，上海埃彼化學(xué)有限公司；酵母膏、蛋白胨，分析純，青島青藥生物工程有限公司；MgSO4·7H2O、NaNO3、(NH4)2SO4、K2HPO4、KCl、CuSO4、NaOH、FeSO4，分析純，廣東予能實驗室設(shè)備科技有限公司；瓊脂粉，分析純，北京天馬華信化工有限公司；消泡劑，食品級，上海廣銳生物科技有限公司；馬鈴薯，市售。

1.1.3 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基(g·L-1)[14]：馬鈴薯200.0，葡萄糖20.0，瓊脂粉18.0，pH值 7.0～7.2。121 ℃高壓滅菌20 min。

種子培養(yǎng)基(g·L-1)[15]：NaNO33.0，KH2PO41.0，MgSO4·7H2O 0.5，KCl 0.5，F(xiàn)eSO40.01，蔗糖 30.0，消泡劑0.1，pH值 7.0～7.2。121 ℃高壓滅菌20 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g·L-1)[16]：可溶性淀粉50.0，玉米漿10.0，NaNO32.0，K2HPO40.6，KCl 0.5，MgSO4·7H2O 0.4，消泡劑0.1，pH 值7.0～7.2。121 ℃高壓滅菌20 min。

1.2 儀器

BBS-DDC型臺式超凈工作臺，山東博科科學(xué)儀器有限公司；SPX-80A型生化培養(yǎng)箱，上海恒躍醫(yī)療器械有限公司；TS-100C型恒溫搖床，上海善志儀器設(shè)備有限公司；BLBIO-20SJ型機械攪拌通風(fēng)式發(fā)酵罐，上海百侖生物科技有限公司；TG臺式高速離心機，上海盧湘儀離心機儀器有限公司；LDZX-50KBS型高壓滅菌鍋，廈門森泰儀器儀表有限公司；Agilent1260型高效液相色譜儀，美國Agilent Technologies公司。

1.3 方法

1.3.1 種子液的制備

將保藏的SX2018-06菌種轉(zhuǎn)接到斜面培養(yǎng)基，30 ℃活化培養(yǎng)168 h。取2 cm3的SX2018-06生長旺盛的菌塊，接種到250 mL含有100 mL種子培養(yǎng)基的三角燒瓶中，28 ℃、200 r·min-1條件下振蕩培養(yǎng)70 h，即為種子液。

1.3.2 單因素實驗

取種子液接入發(fā)酵罐，接種量為10%，設(shè)定初始pH值為6.0、發(fā)酵溫度為28 ℃、通氣量為5.0 L·min-1，連續(xù)發(fā)酵190 h?？疾彀l(fā)酵溫度、初始pH值、通氣量、接種量等因素對SX2018-06產(chǎn)PDG的影響。

1.3.3 響應(yīng)面實驗

根據(jù)單因素實驗結(jié)果，以PDG產(chǎn)量(Y)為響應(yīng)值，以發(fā)酵溫度(X1)、初始pH值(X2)、通氣量(X3)、接種量(X4)為考察因子，采用Box-Behnken進行4因素3水平響應(yīng)面實驗設(shè)計[17-19]，SX2018-06產(chǎn)PDG發(fā)酵條件優(yōu)化Box-Behnken實驗的因子與水平見表1。

表1 SX2018-06產(chǎn)PDG發(fā)酵條件優(yōu)化Box-Behnken實驗的因子與水平

Tab.1 Factors and levels of Box-Behnken experiment for optimization of fermentation conditions of PDG produced by SX2018-06

1.3.4 PDG含量的測定

PDG含量測定方法參照文獻[20-22]。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理

用Design Expert 8.0.6軟件對實驗數(shù)據(jù)[23-24]進行線性回歸和方差分析，通過SPSS軟件進行顯著性分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素實驗結(jié)果

2.1.1 發(fā)酵溫度對SX2018-06產(chǎn)PDG的影響(圖1)

圖1 發(fā)酵溫度對SX2018-06產(chǎn)PDG的影響Fig.1 Effect of fermentation temperature on production of PDG by SX2018-06

從圖1可看出，PDG產(chǎn)量隨發(fā)酵溫度的升高，呈現(xiàn)出先增加后下降的倒“U”型形狀；在溫度為28 ℃時，PDG產(chǎn)量最大，達到42.24 mg·L-1。分析原因可能是，SX2018-06通過代謝合成PDG過程需要一系列酶的催化，酶催化活性受溫度調(diào)控。只有溫度達到某一值時，酶的催化活性最大，低于或高于這個值催化活性都會降低。所以，SX2018-06產(chǎn)PDG的最適發(fā)酵溫度為28 ℃。

2.1.2 初始pH值對SX2018-06產(chǎn)PDG的影響(圖2)

圖2 初始pH值對SX2018-06產(chǎn)PDG的影響Fig.2 Effect of initial pH value on production of PDG by SX2018-06

由圖2可看出，初始pH值從5.0升高到7.5的過程中，PDG產(chǎn)量逐漸增加，當(dāng)pH值達到6.5時，PDG產(chǎn)量達到最高；當(dāng)pH值大于6.5之后，PDG產(chǎn)量逐漸下降。分析原因可能是，SX2018-06合成PDG的酶系在初始pH值為6.5時，有最大的催化活性。所以，SX2018-06產(chǎn)PDG最適初始pH值為6.5。

2.1.3 通氣量對SX2018-06產(chǎn)PDG的影響(圖3)

由圖3可看出，通氣量從3.0 L·min-1增加到8.0 L·min-1的過程中，PDG產(chǎn)量呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢；當(dāng)通氣量為7.0 L·min-1時，PDG產(chǎn)量最大，達到42.71 mg·L-1。分析原因可能是，SX2018-06是好氧真菌，在代謝過程中代謝的速率會隨著環(huán)境中氧氣的含量變化而變化。所以，SX2018-06產(chǎn)PDG最適通氣量為7.0 L·min-1。

圖3 通氣量對SX2018-06產(chǎn)PDG的影響Fig.3 Effect of ventilation amount on production of PDG by SX2018-06

2.1.4 接種量對SX2018-06產(chǎn)PDG的影響(圖4)

圖4 接種量對SX2018-06產(chǎn)PDG的影響Fig.4 Effect of inoculation rate on production of PDG by SX2018-06

從圖4可看出，當(dāng)接種量從8%增加到13%的過程中，PDG產(chǎn)量呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢；當(dāng)接種量為12%時，PDG產(chǎn)量最大，達到43.15 mg·L-1。分析原因可能是，接種量小時，達不到發(fā)酵的菌濃，PDG產(chǎn)量較??；但是當(dāng)接種量過大時，發(fā)酵罐內(nèi)的菌濃過大，會造成菌種之間對營養(yǎng)物質(zhì)和發(fā)酵條件的過度競爭，從而降低PDG產(chǎn)量。所以，SX2018-06產(chǎn)PDG最適接種量為12%。

2.2 響應(yīng)面實驗結(jié)果

2.2.1 回歸模型的建立

SX2018-06產(chǎn)PDG發(fā)酵條件優(yōu)化Box-Behnken實驗結(jié)果見表2。

用統(tǒng)計軟件Design Expert 8.0.6對實驗結(jié)果進行多元回歸擬合，二次多項式回歸方程為：

表2 SX2018-06產(chǎn)PDG發(fā)酵條件優(yōu)化Box-Behnken實驗結(jié)果

Tab.2 Results of Box-Behnken experiment for optimization of fermentation conditions of PDG produced by SX2018-06

2.2.2 回歸模型的方差分析

SX2018-06產(chǎn)PDG發(fā)酵條件優(yōu)化回歸模型方差分析見表3。

表3 SX2018-06產(chǎn)PDG發(fā)酵條件優(yōu)化回歸模型方差分析

Tab.3 Variance analysis of regression model for optimization offermentation conditions of PDG produced by SX2018-06

注：*表示對結(jié)果影響顯著(P<0.05)；**表示對結(jié)果影響極顯著(P<0.01)。

由表3可知，模型極顯著(P<0.01)，失擬項不顯著(P>0.05)，表明回歸模型的擬合度較好。

2.2.3 響應(yīng)面圖的分析

發(fā)酵溫度、初始pH值、通氣量和接種量4個影響因子兩兩交互作用對SX2018-06產(chǎn)PDG的影響的響應(yīng)面及等高線見圖5。

圖5 不同因子交互影響PDG產(chǎn)量的響應(yīng)面圖Fig.5 Response surface maps of PDG production influenced by different factors

從圖5可看出，A圖、B圖、C圖和F圖，響應(yīng)面圖形呈現(xiàn)出拋物面形狀，說明4對交互因子(X1X2、X1X3、X1X4、X3X4)在實驗范圍內(nèi)，響應(yīng)值均有極大值。等高線均呈現(xiàn)橢圓形，也說明4對交互因子對結(jié)果影響顯著，與前面方差分析的結(jié)果是一致的。

2.3 驗證實驗

二次多項式回歸方程采用Design Expert 8.0.6軟件求解， SX2018-06產(chǎn)PDG最優(yōu)的發(fā)酵條件為：發(fā)酵溫度27.69 ℃、初始pH值5.85、通氣量6.26 L·min-1、接種量為12.32%，預(yù)測PDG產(chǎn)量為42.68 mg·L-1。根據(jù)方程的求解和實際發(fā)酵情況，確定優(yōu)化的發(fā)酵條件為：發(fā)酵溫度28.0 ℃、初始pH值6.0、通氣量6.5 L·min-1、接種量12.5%。根據(jù)優(yōu)化的發(fā)酵條件，連續(xù)做3個重復(fù)，平均PDG產(chǎn)量為43.28 mg·L-1，和預(yù)測值非常接近。所以，回歸模型和實際情況擬合度較好。PDG產(chǎn)量比優(yōu)化前提高了132.31%。

3 結(jié)論

對實驗室篩選的產(chǎn)PDG的杜仲內(nèi)生真菌SX2018-06進行發(fā)酵工藝條件優(yōu)化，通過相應(yīng)的實驗設(shè)計，得到優(yōu)化的發(fā)酵工藝條件為：發(fā)酵溫度28.0 ℃、初始pH值6.0、通氣量6.5 L·min-1、接種量12.5%，在此優(yōu)化條件下，PDG產(chǎn)量達到43.28 mg·L-1，較優(yōu)化前提高了132.31%。本研究所構(gòu)模型可顯著提高杜仲內(nèi)生真菌SX2018-06發(fā)酵產(chǎn)PDG產(chǎn)量，為規(guī)?；a(chǎn)提供了理論和實踐的基礎(chǔ)。