王林莉 龐文生 胡 娟,2*

1.福建中醫(yī)藥大學藥學院，福建 福州 350122；2.福建中醫(yī)藥大學附屬第二人民醫(yī)院，福建 福州 350003

糖尿病足(diabetic foot) 是糖尿病慢性致殘性并發(fā)癥，又叫糖尿病肢端壞疽；即糖尿病患者合并各種不同程度末梢血管病變和神經(jīng)病變導致下肢感染、潰瘍和/或深部組織破壞[1]。目前全球糖尿病患者高達4.25億，而中國糖尿病人數(shù)最多，達1.14億，此外還有3.5億多糖尿病高危人群[2]。糖尿病足部潰瘍，是糖尿病常見嚴重并發(fā)癥，糖尿病患者患有血管病變、神經(jīng)病變等并發(fā)癥，如周圍神經(jīng)炎、周圍血管病變和膠原異常，導致皮膚創(chuàng)傷難治性，往往發(fā)展為慢性難愈性潰瘍。此即糖尿病患者殘疾，非創(chuàng)傷性下肢截肢的主要原因[3]。

我國古籍中對糖尿病足的記載始見于《黃帝內(nèi)經(jīng)》的《靈樞·癰疽篇》，書中寫到：“發(fā)于足趾，名脫癰。其狀赤黑，死不治；不赤黑，不死，治之。不衰，急斬之，不則死矣”。宋代竇漢卿《竇氏外科全書·卷二·附甲背發(fā)說》曰：“甲背發(fā)，此癥由消渴之癥發(fā)于手足指，名曰脫疽，其狀赤紫者死，不赤者可治”。清代高秉鈞所著《瘍科心得集》云：脫疽者，足指生疔，重者潰而紫黑，不疼不癢，久則脫去其節(jié)，故名之。亦有患于手指者，名曰蛀節(jié)疔，重者腐去本節(jié)，輕者痙攣。歷代古籍中對糖尿病足的稱謂有所變化，有脫癰、脫疽等；但都描述出了糖尿病足的病狀及其難愈、致殘致死的特征。

研究表明[4-8]，黃芪多糖、靈芝多糖、白及多糖及天然多糖水凝膠等能促進糖尿病足潰瘍的愈合，促進潰瘍部位成纖維細胞的增殖以及膠原合成。太子參多糖是太子參中具有多種生物活性的一類物大分子物質(zhì)。國內(nèi)外多名學者的研究表明，太子參多糖具有降血糖、改善糖耐量、促進胰島素分泌、保濕、抗衰老、皮膚組織修復等作用，同時可提供濕性愈合環(huán)境加速創(chuàng)面愈合[9-11]。因此，研究以大鼠糖尿病足潰瘍創(chuàng)面愈合率為指標，探討太子參多糖治療大鼠糖尿病足潰瘍的藥效，以期為中藥太子參進一步開發(fā)和利用提供新的思路。

1 材料與儀器

1.1 實驗動物 健康Wistar雄性大鼠32只，體重180±20 g，清潔級，實驗動物飼養(yǎng)于福建省中醫(yī)藥研究院動物中心。大鼠采用單籠喂養(yǎng)，喂養(yǎng)溫度：25 ℃左右，濕度60%左右。大鼠喂食實驗動物配合飼料，自由攝食及飲水。

1.2 儀器 中藥材提取罐設(shè)備(武漢中大制藥設(shè)備有限公司)；藥材粉碎機(天津市泰斯特儀器有限公司)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)；低溫冷卻循環(huán)泵(鄭州長城科工貿(mào)有限公司)；MOKULYOD-230型冷凍干燥儀(Thermo Fisher公司)；艾科靈銳2血糖測試儀(艾康生物技術(shù)有限公司)。

1.3 試劑 太子參藥材(福建柘參種業(yè)有限公司)；無水乙醇(國藥集團化學試劑有限公司)；生理鹽水(北京三藥科技開發(fā)公司)；鏈脲佐菌素(批號：S0130、SIGMA-ALDRICH公司)；檸檬酸(批號：15070701、西隴化工股份有限公司)；檸檬酸鈉(批號：1811291、西隴科學股份有限公司)；三氯乙醛水合物(批號：C10323759、MACKLIN)；重組人表皮細胞生長因子外用溶液(批號：20190204、深圳市華生元基因工程發(fā)展有限公司)。

1.4 試劑配制方法

①太子參多糖，臨用時用生理鹽水配制成所需濃度的太子參多糖溶液。2 g太子參多糖，用50 ℃生理鹽水溶解，定容至10 mL；4000 r離心15 min，取上清，制備成0.20 g/mL的太子參多糖溶液。

②10%水合氯醛溶液制備：取5 g水合氯醛，于燒杯中加適量無菌生理鹽水溶解后，定容至50 mL。0.22 μm濾膜過濾后備用。

③枸櫞酸鈉緩沖溶液的配制:檸檬酸(FW：210.14)2.1 g加入雙蒸水100 mL中配成A液。檸檬酸鈉(FW：294.10)2.94 g加入雙蒸水100 mL中配成B液。用時將A、B液按1∶1的比例混合，PH計測定PH值，調(diào)節(jié)PH=4.2-4.5，0.22 μm濾膜過濾，即是0.1 mmol/L的枸櫞酸鈉緩沖液。

④鏈脲佐菌素溶液的配制:以0.1 mmol/L的枸櫞酸鈉緩沖液(PH=4.2-4.5)，在4℃條件下，將鏈脲佐菌素配制成1%STZ溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

2 方法

2.1 太子參多糖提取 取太子參粉碎(過20目篩)，置于圓底燒瓶內(nèi)，加入90%乙醇(1∶5，m/v)，室溫下浸泡1 h。80℃加熱，回流提取2次，每次1.5 h。經(jīng)紗布過濾，濾渣揮干乙醇，裝入紗布袋，置于中藥提取罐，按料液比1∶9加入蒸餾水，浸泡1 h，100℃提取2 h后，過濾。重復提取兩次，合并兩次濾液，減壓蒸發(fā)濃縮至生藥量約0.5 g/mL。濃縮液加入乙醇調(diào)至終濃度為90%乙醇醇沉。4℃環(huán)境下沉淀24 h后，棄去上層乙醇液，-80℃冰箱冷藏后，真空冷凍干燥，得太子參多糖粉末。臨用時取2 g太子參多糖，用50℃生理鹽水溶解，定容至10 mL；4000 r離心15 min，取上清，制備成0.20 g/mL的太子參多糖溶液。

2.2 大鼠糖尿病足潰瘍模型的制備 4周齡Wistar雄性大鼠32只，體重(180±20)g，清潔級，適應(yīng)性飼養(yǎng)3天后用于實驗。大鼠禁食不禁水12 h后，稱重，尾靜脈采血測大鼠基礎(chǔ)血糖。隨機選取24只大鼠，以40 mg/kg的劑量，給予1%STZ溶液左下腹注射，制備大鼠高血糖模型。剩余8只作為空白對照組，給予等劑量0.1 mmol/L枸櫞酸鈉緩沖溶液腹腔注射。注射72 h后 連續(xù)3 d監(jiān)測空腹血糖，依據(jù)《輔助降血糖功能評價方法》的標準以血糖值在10～25 mmol/L為高血糖模型成功大鼠。

采用腹腔注射10%水合氯醛溶液0.3 mL/100 g麻醉大鼠后，于大鼠的足背皮膚，用印章作一3 mm×7 mm矩形標記，切除全層皮膚，75%酒精棉球消毒創(chuàng)面，形成缺損性足部皮膚潰瘍大鼠模型。

2.3 分組及給藥 32只Wistar雄性大鼠分為4組，其中空白對照組8只，其余24只高血糖模型大鼠隨機分為模型組、金因肽外用陽性組、太子參多糖外用組，每組8只。空白對照組大鼠給予等體積生理鹽水外用，模型組大鼠給予等體積生理鹽水外用，金因肽外用陽性組大鼠給予重組人表皮細胞生長因子外用溶液局部均勻噴濕創(chuàng)面，每日1次，約4000 IU/10×10 cm2，太子參多糖外用組大鼠足潰瘍創(chuàng)面給予太子參多糖外涂，每天2次。

2.4 大鼠糖尿病及糖尿病足潰瘍模型指標測定

2.4.1 血糖 測定大鼠連續(xù)給藥周期內(nèi)監(jiān)測其空腹血糖的變化情況，每隔7 d，各組均禁食不禁水6 h，尾靜脈采血，血糖儀測定空腹血糖值。

2.4.2 大鼠體征的觀察及體重測定 觀察大鼠是否出現(xiàn)多飲、多食、多尿、體重減輕的“三多一少”癥狀。連續(xù)給藥周期內(nèi)，每隔7 d監(jiān)測一次體重并進行記錄。

2.4.3 大鼠糖尿病足潰瘍創(chuàng)面監(jiān)測 觀察各組大鼠創(chuàng)面愈合的情況，每隔7 d對大鼠足潰瘍創(chuàng)面愈合情況進行拍照記錄。采用Image-pro plus圖像處理分析軟件獲取JPEG格式圖像數(shù)據(jù)，評估創(chuàng)面愈合情況。使用顏色及對比度濾鏡增強圖像后，依據(jù)創(chuàng)面呈紅色與背景膚色的區(qū)別，選取紅色創(chuàng)面為測量區(qū)域，測量創(chuàng)面面積，計算創(chuàng)面愈合率。

創(chuàng)面愈合率=(原始創(chuàng)面總面積-未愈創(chuàng)面面積)/原始創(chuàng)面總面積×100%

2.5 統(tǒng)計學分析 采用SPSS22.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，符合正態(tài)分布的計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用t檢驗，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 大鼠體征的觀察及體重測定 造模組大鼠體型消瘦，倦怠乏力，毛發(fā)黯淡發(fā)灰，出現(xiàn)多飲、多食、多尿、體重減輕的“三多一少”癥狀。

3.2 大鼠空腹血糖結(jié)果 大鼠連續(xù)給藥后第7 d及第14 d，各組均禁食不禁水 6 h后，尾靜脈采血，血糖儀測定大鼠空腹血糖值。由表1可見，造模后治療前即0 d，空白對照組大鼠平均血糖(4.43±0.52)處于正常水平，但模型對照組大鼠平均血糖(16.94±4.09)，證明高血糖大鼠造模成功。太子參多糖外用治療大鼠足潰瘍7day和14day，空白對照組大鼠平均血糖分別為(4.46±0.50)和(4.59±0.43)均處于正常水平；但模型組、陽性對照組、太子參多糖治療組大鼠血糖一直維持在(18.96±6.13)～(23.48±5.13)較高水平；給藥周期內(nèi)，高血糖大鼠血糖值仍然處于較高水平，即外用金因肽和太子參粗多糖并不能降低高血糖大鼠血糖值，同時高血糖大鼠血糖值也無自然恢復。

組別0d7d14d空白組4.43±0.524.46±0.504.59±0.43模型組16.94±4.0918.96±6.1322.23±4.45金因肽外用陽性組19.36±3.9322.63±7.7823.61±3.43太子參粗多糖外用組17.71±3.1322.58±4.9223.48±5.13

3.3 大鼠糖尿病足潰瘍創(chuàng)面愈合結(jié)果 由圖1可知，造足部潰瘍模型后，各組大鼠潰瘍創(chuàng)面鮮紅，可見明顯的炎性膿液滲出。造模后第7 d，空白組創(chuàng)面結(jié)痂脫落，傷痕收縮紅活；模型組創(chuàng)面結(jié)成黃褐色痂，且創(chuàng)面仍有稀薄膿性分泌物；陽性組和多糖外用組創(chuàng)面結(jié)成紅褐色痂，創(chuàng)面收縮。造足部潰瘍模型后第14 d，空白組創(chuàng)面全部愈合，足部留有淡淡的傷痕；陽性組創(chuàng)面大多愈合，創(chuàng)面有干燥皮屑脫落；多糖外用組創(chuàng)面基本愈合，少有一點黑星小痂；模型組創(chuàng)面大都留有紅褐色結(jié)痂。采用Image-pro plus圖像處理分析軟件計算各組大鼠創(chuàng)面愈合率，由表2、圖2可知，給藥后第14 d，各組大鼠創(chuàng)面基本愈合。給藥周期內(nèi)各組大鼠足潰瘍創(chuàng)面愈合的效果為，空白組好于金因肽外用陽性組、好于太子參多糖外用組好于模型組。造足部潰瘍模型后，空白組的正常動物創(chuàng)面結(jié)痂和愈合速度明顯快于糖尿病動物，表明高血糖影響大鼠足潰瘍創(chuàng)面的愈合。太子參多糖外用組及陽性組結(jié)痂和愈合速度明顯快于模型組，與模型組相比，差異具有非常顯著統(tǒng)計學意義(P<0.01)，說明了太子參多糖具有促進高血糖大鼠足潰瘍創(chuàng)面愈合的藥效。

組別例數(shù)Day7Day14空白組879.82%±0.05**100.00%±0.00**模型組847.34%±0.1388.33%±0.07金因肽外用陽性組868.32%±0.11**△99.90%±0.003**△20%太子參粗多糖外用組865.13%±0.09**△98.62%±0.02**△

注：與模型組相比，*P<0.05，**P<0.01；陽性對照與治療組相比，△P>0.05。

4 討論

糖尿病可引起神經(jīng)和血管損傷，持續(xù)高血糖可導致基于周圍神經(jīng)病變的全身性多部位神經(jīng)損傷，使糖尿病患者肢端缺血和對傷痛的感覺不靈敏，增加了糖尿病足潰瘍這一并發(fā)癥出現(xiàn)的風險。持續(xù)高血糖會導致上皮細胞功能障礙，導致促血管生成信號和一氧化氮生成減少。此外，高血糖患者白細胞功能受損，免疫功能受損，相關(guān)部位免疫應(yīng)答不足，使糖尿病足這一糖尿病常見并發(fā)癥更難愈合[12]。

實驗型糖尿病足潰瘍動物模型的制備多是在糖尿病模型的基礎(chǔ)上配合外部干預建立的。鏈脲佐菌素這一藥物對哺乳動物的胰島β細胞有特異毒性，造成胰島素分泌低下，引起實驗性糖尿病，此藥物性糖尿病模型制備操作簡便，成模周期短，被廣泛用于誘導糖尿病動物模型。鏈脲佐菌素的注射劑量是決定糖尿病模型成功與否的關(guān)鍵，一次性腹腔注射STZ 50 mg/kg以上劑量，大鼠胰島細胞大量被破壞，血糖迅速升高，極容易造成死鼠，不利于對糖尿病進一步研究；40 mg/kg以下劑量造模血糖上升趨勢緩慢，成模率低，其可能處于胰島素抵抗早期，胰島β細胞為代償胰島素抵抗而分泌更多的胰島素進而控制血糖上升。本實驗以40 mg/kg的劑量，給予1%STZ溶液左下腹注射，制備大鼠高血糖模型。造模后大鼠血糖一直維持在較高水平[(16.94±4.09)～(23.61±3.43)]，出現(xiàn)多飲、多食、多尿、體重減輕的“三多一少”癥狀，符合臨床糖尿病患者的病癥特征；進而于高血糖大鼠足背部切除一矩形全層皮膚組織，建立糖尿病足潰瘍模型[13]。

目前難治性糖尿病足潰瘍還沒有理想的特效藥，植物多糖具有皮膚組織修復等作用，同時可提供濕性愈合環(huán)境加速創(chuàng)面愈合。本文通過空白組、模型組、金因肽外用陽性組、太子參多糖外用組大鼠足潰瘍創(chuàng)面愈合率的對比，證明了太子參多糖具有促進高血糖大鼠足潰瘍創(chuàng)面愈合的藥效，為中藥太子參進一步開發(fā)和利用提供了新的思路。