趙 南，王松濤，劉慶國，鄒亞男，陳 勇

(1.南京高新工大生物技術(shù)研究院有限公司，江蘇 南京 210032；2.瀘州品創(chuàng)科技有限公司，四川 瀘州646000；3.南京工業(yè)大學(xué)，江蘇 南京 211816)

蟲草素是第一個(gè)從真菌中分離出來的核苷類抗生素，具有抑菌、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)和抗炎癥等生物學(xué)活性，由一個(gè)3-脫氧的核糖和腺嘌呤通過糖苷化連接而成。蟲草素有化學(xué)法和生物法兩種合成方法，其中化學(xué)合成工藝主要是以腺苷為原料，通過將腺苷的3′-位羥基溴代，再用自由基還原去除3′-位的溴制備蟲草素?；瘜W(xué)合成蟲草素的過程中副產(chǎn)物較多，分離純化的難度較大，因此目前蟲草素合成多采用生物法[1]。

蛹蟲草是生物法制備蟲草素重要的菌株之一。傳統(tǒng)的生物法制備是人工子實(shí)體固態(tài)培養(yǎng)，發(fā)酵工藝規(guī)模性體量大，耗時(shí)耗力，單位空間產(chǎn)量較低[1]。另一種生物合成的方法是通過液態(tài)淺層發(fā)酵，采用液體發(fā)酵技術(shù)培養(yǎng)蛹蟲草菌絲體，其菌絲體生長迅速，生產(chǎn)周期短，蟲草素產(chǎn)量高，提取工藝較為簡(jiǎn)單。此發(fā)酵工藝是目前大規(guī)模生產(chǎn)蟲草素的主流方法[2]。

液體發(fā)酵法生產(chǎn)蟲草素最為關(guān)鍵的因素是菌株活性。傳統(tǒng)菌株篩選法是以菌落形態(tài)或目標(biāo)產(chǎn)物濃度為指標(biāo)，采用大量平板培養(yǎng)或搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)進(jìn)行篩選，存在勞動(dòng)量大、周期長和成本高等缺點(diǎn)[3]。高通量篩選技術(shù)具有自動(dòng)、微量和高效等優(yōu)點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于微生物菌株選育，大幅提高了高產(chǎn)菌株篩選效率[4-7]。目前蛹蟲草誘變方法研究較多，如硫酸二乙酯(DES)[8]和氯化鋰(LiCl)[9]等化學(xué)誘變和γ射線誘變[10]、離子束誘變[11]、原生質(zhì)體紫外(UV)誘變[12]等物理誘變；另外也有不少復(fù)合誘變，如 UV-DES(硫酸二乙酯)[13]、LiCl-UV[14]和60Coγ-UV[15]等。但鮮見有關(guān)高通量篩選和復(fù)合誘變技術(shù)相結(jié)合選育蟲草素高產(chǎn)菌株的研究報(bào)道。另外，由于蛹蟲草發(fā)酵溫度較低，能耗較大，發(fā)酵周期仍較長，蟲草素產(chǎn)率不理想，嚴(yán)重制約了其大規(guī)模生產(chǎn)。因此，本文利用紫外-常壓室溫等離子體復(fù)合誘變提高蛹蟲草正突變概率，通過多孔板高通量篩選提高蟲草素高產(chǎn)蛹蟲草菌株篩選效率，并采用溫度梯度馴化獲得耐高溫的高產(chǎn)蟲草素菌株，以期為蛹蟲草高產(chǎn)菌株的選育提供一種高效的方法。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與器材

蛹蟲草CICC 14014，購自工業(yè)微生物保藏中心。Cellulase購自Solarbio 公司(日本) ； 蝸牛酶和溶壁酶均購自SIGMA；蟲草素標(biāo)樣購自Sigma公司(美國) ；葡萄糖、硫酸鎂、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、酵母浸粉、腺嘌呤和甘氨酸等試劑為國產(chǎn)分析純；進(jìn)口酵母粉和蛋白胨均為OXOID。SX-700立式全自動(dòng)滅菌鍋購自TOMY公司；ZQZY-CF震蕩培養(yǎng)箱購自上海知楚儀器有限公司；SW-CJ-1BU超凈臺(tái)購自蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司。另有GENESYS 10S UV-Vis紫外可見分光光度計(jì)、Molecular Device QPix 420 全自動(dòng)菌落挑選儀、Agilent1200高效液相色譜儀(HPLC)等儀器。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)基的制備 固體培養(yǎng)基：土豆汁(將200 g新鮮土豆切塊，定容至1 L，煮沸30 min，過濾)、葡萄糖15 g、磷酸二氫鉀2.5 g、七水硫酸鎂2 g，瓊脂18 g，定容至1 L。

原生質(zhì)體培養(yǎng)基：向固體培養(yǎng)基中加0.5 mol/L的蔗糖。

種子培養(yǎng)基：葡萄糖40 g/L、蛋白胨12 g/L、酵母粉10 g/L、磷酸氫二鉀0.55 g/L、磷酸二氫鉀0.55 g/L、無水硫酸鎂0.2 g/L，用 5 mol/L鹽酸調(diào)節(jié) pH 至 6.0。

發(fā)酵培養(yǎng)基：向種子培養(yǎng)基中加4 g/L的腺嘌呤。

1.2.2 原生質(zhì)體的制備 刮取一環(huán)蟲草菌絲體于固體培養(yǎng)基上，25 ℃培養(yǎng) 4～6 d，菌絲體長好后收集菌絲體。用Miracloth濾布過濾得菌絲體。刮取1勺濕菌絲體置于30 mL裂解酶液[0.6 mol/L NaCl，2%(v/v) 纖維素酶、5 g/L蝸牛酶和溶壁酶]，25 ℃、160 r/min酶解2～3 h，2 h后每隔0.5 h取樣用顯微鏡觀察，待絕大部分菌絲形成圓形結(jié)構(gòu)后，用Miracloth濾布過濾收集濾液，4000 r/min離心5～10 min，棄上清得原生質(zhì)體沉淀；用0.6 mol/L氯化鈉漂洗2次后重懸，制得原生質(zhì)體懸液，備用。

1.2.3 UV-ARTP復(fù)合誘變 用移液槍取原生質(zhì)體懸液4 mL置于無菌培養(yǎng)皿中，在紫外(功率30 W，距離40 cm)下分別照射 0、1、2、3、4、5、6 min，然后稀釋涂布于原生質(zhì)體培養(yǎng)基平板，每個(gè)時(shí)間設(shè)置3個(gè)平行，制作致死曲線，取致死率70%的時(shí)間點(diǎn)作為復(fù)合誘變中紫外照射時(shí)間。取紫外照射過的原生質(zhì)體懸液10 μL均勻涂布在滅菌載片表面，將裝有載片的平皿轉(zhuǎn)移至提前滅菌的ARTP誘變儀工作腔中。在工作功率120 W、工作氣流10 SLM、照射距離2 mm條件下設(shè)置照射時(shí)間0、10、20、30、40、50、60 s。將處理過的帶菌載片于1 mL生理鹽水的EP管中充分混勻，稀釋涂布于再生平板，每個(gè)時(shí)間設(shè)置3個(gè)平行，置于25 ℃下培養(yǎng)3～5 d。致死率(DR)公式：DR(%) =(C0-Ct) /C0×100%。

其中：C0為初始原生質(zhì)體再生菌落數(shù)；Ct為誘變后再生菌落數(shù)，單位均為cfu/mL。

1.2.4 96孔板高通量初篩與三角瓶復(fù)篩 用全自動(dòng)菌落挑選儀挑取誘變后的單菌落(復(fù)合誘變30、40、50 s的平板菌落各30個(gè))接入裝有固體培養(yǎng)基的96孔深孔板，于25 ℃培養(yǎng)5～7 d，隨后轉(zhuǎn)接到96孔深孔板，每個(gè)孔裝1 mL的種子培養(yǎng)基，置于溫度25 ℃、轉(zhuǎn)速 210 r/min的震蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d；再按接種量12%轉(zhuǎn)接到裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的多孔板中，裝液量同樣為1 mL；然后置于25 ℃的培養(yǎng)箱中靜置發(fā)酵28 d。根據(jù)發(fā)酵結(jié)束后蟲草素測(cè)定結(jié)果，將預(yù)先保藏的對(duì)應(yīng)高產(chǎn)蟲草素菌株用斜面活化后，接入500 mL無菌三角瓶(裝液量100 mL)，于 25 ℃、210 r/min 條件下培養(yǎng)3 d，然后按10%的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基，于25 ℃條件下靜置培養(yǎng) 28 d。每個(gè)菌株復(fù)篩做3個(gè)平行。

1.2.5 遺傳穩(wěn)定性檢測(cè) 將復(fù)篩的高產(chǎn)突變菌株連續(xù)傳代10次，每隔1代分別進(jìn)行三角瓶發(fā)酵試驗(yàn)，測(cè)定菌體干重和蟲草素產(chǎn)量，以評(píng)估菌株的遺傳穩(wěn)定性。

1.2.6 溫度梯度馴化 將復(fù)篩的高產(chǎn)突變菌株進(jìn)行涂布培養(yǎng)，25 ℃下培養(yǎng)2～3 d，挑取較大的單菌落轉(zhuǎn)至新的平板，26 ℃下傳代2次，進(jìn)行涂布培養(yǎng)；挑取較大的單菌落轉(zhuǎn)至新的平板，27 ℃下進(jìn)行2次傳代；依此進(jìn)行，最終培養(yǎng)溫度為30 ℃。每個(gè)溫度水平挑取菌落進(jìn)行液體淺層發(fā)酵。

1.2.7 蟲草素檢測(cè)方法 取發(fā)酵液樣品10 mL，離心取上清液，稀釋后用HPLC檢測(cè)蟲草素含量。色譜柱：Sepax HP-C18，4.6 mm×250 mm，5 μm，120 ?；檢測(cè)器：紫外波長254 nm；柱溫：30 ℃；流動(dòng)相：甲醇∶磷酸二氫鉀=25∶75；流速：0.8 mL/min；進(jìn)樣量：20 μL。

2 結(jié)果與討論

2.1 復(fù)合誘變

原生質(zhì)體懸液經(jīng)紫外輻照后，取樣稀釋并涂布于平板培養(yǎng)，根據(jù)菌落數(shù)量計(jì)算紫外誘變致死率。由圖1可知，蛹蟲草菌株致死率隨著輻照時(shí)間的增加而提高，輻照4 min時(shí)致死率達(dá)到 80%左右；輻照5 min時(shí)致死率超過90%。研究表明，致死率與正突變呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)關(guān)系，即大劑量或長時(shí)間誘變突變幅度較大，但正突變較少；而小劑量或短時(shí)間輻照誘變突變幅度較小，但相應(yīng)的正突變較多[16]。近年研究發(fā)現(xiàn)，采用70%～80%致死率的誘變劑量效果最佳[17,18]。故本研究取照射4 min為紫外誘變時(shí)間。

紫外照射4 min后，進(jìn)行ARTP誘變處理。ARTP誘變育種的原理是其發(fā)出的等離子體流作用于微生物遺傳物質(zhì)，對(duì)其產(chǎn)生強(qiáng)烈的畸變作用，使得微生物的基因序列和代謝網(wǎng)絡(luò)發(fā)生較大的變異[19]。同時(shí)，具有較高活性的粒子能夠改變微生物遺傳物質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)，而菌株SOS自動(dòng)修復(fù)機(jī)制進(jìn)一步提高有利突變的出現(xiàn)幾率[20]。

由圖2可知，ARTP照射30 s，致死率就達(dá)80%，50 s可達(dá)90%以上。一般復(fù)合突變效果優(yōu)于單一誘變效果，為了提高篩選正突變率，將ARTP處理30～50 s的菌落作為后續(xù)初篩對(duì)象。因此選擇 UV 輻照4 min后ARTP 處理 30～50 s作為初篩的誘變條件。

UV-ARTP復(fù)合誘變菌株經(jīng)過96孔板發(fā)酵初篩，共挑取近300個(gè)菌落，進(jìn)行多孔板種子培養(yǎng)和靜置發(fā)酵。結(jié)果如圖3所示，蟲草素濃度主要集中于4～6 g/L。分別從對(duì)應(yīng)的復(fù)合誘變處理30、40、50 s的高產(chǎn)菌株中，各取10個(gè)菌落進(jìn)一步進(jìn)行搖瓶發(fā)酵復(fù)篩。如表1所示，UA30-3、UA40-6、UA40-10、UA50-6蟲草素產(chǎn)量均超過5.5 g/L，其中，UA40-6的蟲草素產(chǎn)量達(dá)到5.98 g/L，超過出發(fā)菌株146%(出發(fā)菌株的蟲草素產(chǎn)量為2.43 g/L)。利用96孔板和全自動(dòng)菌落挑選儀相結(jié)合的高通量篩選法與傳統(tǒng)搖瓶篩選方法相比，實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)單方便，大幅降低了實(shí)驗(yàn)人員的工作量，顯著縮短了菌株篩選周期。

圖1 紫外誘變致死曲線

圖2 UV-ARTP復(fù)合誘變致死曲線

2.2 遺傳穩(wěn)定性驗(yàn)證

將誘變后的高產(chǎn)菌株UA40-6菌株進(jìn)行連續(xù)傳代培養(yǎng)，每2代分別進(jìn)行種子培養(yǎng)和液體淺層發(fā)酵驗(yàn)證，結(jié)果如圖4所示。蛹蟲草高產(chǎn)突變菌株經(jīng)10次傳代，發(fā)酵濃度均保持在6.0 g/L左右，與未傳代的突變菌株發(fā)酵水平相比，差異不顯著，這與湯佳鵬和汪建雄的研究結(jié)果較為一致，結(jié)果說明復(fù)合誘變獲得的高產(chǎn)突變株具有良好的遺傳穩(wěn)定性。

表1 復(fù)篩菌株產(chǎn)蟲草素情況(選取蟲草素發(fā)酵濃度大于4.5 g/L)

圖3 初篩產(chǎn)量分布

圖4 突變株UA40-6 的遺傳穩(wěn)定性

2.3 溫度馴化

首先將菌株 UA40-6分別在25、26、27、28、29、30 ℃中進(jìn)行固態(tài)培養(yǎng)，結(jié)果如圖5所示，在26 ℃和27 ℃下菌體生長較好，28 ℃下開始出現(xiàn)明顯異常。通過發(fā)酵驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)(圖6)，26 ℃發(fā)酵效果最好，28～31 ℃發(fā)酵的產(chǎn)量呈現(xiàn)明顯下降趨勢(shì)，這與李居寧的研究結(jié)果[21]較為一致。該結(jié)果說明蛹蟲草對(duì)高溫較為敏感。

隨后將誘變菌株 UA40-6依次在26、27、28、29、30 ℃中進(jìn)行溫度馴化， 馴化結(jié)束后進(jìn)行發(fā)酵驗(yàn)證。如圖7所示，在28 ℃環(huán)境下蟲草素產(chǎn)量達(dá)6.56 g/L，相比于誘變初始菌株產(chǎn)量提高了近10%，相比于未馴化菌株同溫度下發(fā)酵產(chǎn)量提高了約26%。結(jié)果說明馴化后的誘變菌株活性明顯提高。

圖5 不同培養(yǎng)溫度對(duì)菌體生長的影響

圖6 不同發(fā)酵溫度對(duì)蟲草素產(chǎn)量影響

圖7 溫度梯度馴化對(duì)蟲草素產(chǎn)量的影響

一般地，溫度梯度馴化是很有效的微生物育種方法，雖然馴化過程耗時(shí)，但馴化效果較好，具有方向性好和遺傳性穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)[22]。通過溫度馴化后的高產(chǎn)蛹蟲草菌株在平板培養(yǎng)無顯著變化情況下，菌株的適應(yīng)溫度從25 ℃提高至28 ℃，發(fā)酵產(chǎn)量也明顯提高，這將更有利于工業(yè)化生產(chǎn)。

3 結(jié)論

以蛹蟲草CICC14014菌株為出發(fā)菌株，經(jīng)紫外和ARTP復(fù)合誘變?cè)|(zhì)體，獲得了超過50%以上高產(chǎn)蟲草素菌株(4～6 g/L)，與出發(fā)菌株發(fā)酵產(chǎn)量(2.43 g/L)相比有明顯提高。同時(shí)利用96孔板高通量篩選和搖瓶復(fù)篩方法獲得了4株具有較高產(chǎn)量的蟲草突變株，蟲草素發(fā)酵濃度均大于5.5 g/L。在此基礎(chǔ)上，對(duì)其中高產(chǎn)菌株 UA40-6進(jìn)行傳代培養(yǎng)驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)其遺傳穩(wěn)定性較強(qiáng)，發(fā)酵濃度維持在6 g/L左右，沒有明顯下降趨勢(shì)。結(jié)果說明 UV 和 ARTP復(fù)合誘變并結(jié)合高通量篩選可快速獲得穩(wěn)定性好的高產(chǎn)菌株。

另外，對(duì)復(fù)合誘變菌株采用溫度梯度馴化，經(jīng)過10輪馴化作用，誘變菌株可耐28 ℃，相比于初始發(fā)酵溫度提高了3 ℃，最終產(chǎn)量可達(dá)6.56 g/L，較初始發(fā)酵水平有明顯提升。發(fā)酵溫度的提高有利于降低生產(chǎn)中的冷卻能耗，同時(shí)產(chǎn)量的提高進(jìn)一步降低生產(chǎn)成本，對(duì)蟲草素生產(chǎn)具有較高的應(yīng)用價(jià)值。