李 丹,謝芝勛,李 孟,羅思思,謝麗基,張民秀,黃嬌玲,范 晴,王 盛,謝志勤,鄧顯文,曾婷婷,張艷芳

(廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所/廣西獸醫(yī)生物技術(shù)重點實驗室,廣西 南寧 530001)

禽流感病毒(Avian influenza virus, AIV)是正黏病毒科成員。根據(jù)其表面抗原血凝素蛋白(Hemagglutinin, HA)和神經(jīng)氨酸酶蛋白(Neuraminidase, NA)的差異可以將AIV劃分為18種不同的HA亞型(H1～H18)和11種不同的NA亞型(N1～N11)[1-3]。另外,依據(jù)其對雞致病性的不同,還可將AIV分為高致病性AIV(HPAIV)和低致病性AIV(LPAIV)。H9亞型AIV自1966年在美國威斯康星州首次被發(fā)現(xiàn)以來,目前已經(jīng)在全球給家禽養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴重的經(jīng)濟損失[4]。1998年在中國廣東首次發(fā)現(xiàn)了H9N2亞型AIV直接感染人的病例,此后H9N2亞型AIV感染人的病例也不斷有報道[5]。H10亞型AIV于1949年在德國雞體內(nèi)首次被發(fā)現(xiàn)[6]；研究表明H10亞型AIV感染的宿主主要為水鳥和其它陸生禽類[7]。目前感染人的亞型主要是H10N7和H10N8亞型,已經(jīng)有報道的國家包括澳大利亞、埃及和中國[8]。更為嚴重的是江西南昌地區(qū)已經(jīng)于2013年12月發(fā)現(xiàn)1例H10N8直接感染人的病例[9]。近年來在低致病性禽流感的流行病學的監(jiān)測中發(fā)現(xiàn)H9和H10亞型禽流感病毒混合感染普遍存在[10]；相關(guān)研究還表明部分H9N2亞型AIV可以為H5N6、H10N8及H7N9等感染人的亞型禽流感病毒提供內(nèi)部基因[11,12]。因此,H9與H10亞型AIV對家禽養(yǎng)殖及人類健康衛(wèi)生具有重要意義。

采用傳統(tǒng)的方法檢測禽流感病毒存在病毒分離培養(yǎng)周期長的缺陷，且需要血清學方法鑒定,而血清學方法則要用到較多的標準陽性血清,但是禽流感病毒不同亞型血清相互之間又存在不同程度的交叉免疫保護反應(yīng),其結(jié)果的準確性具有局限性,所以目前禽流感病毒較多的采用分子生物學方法進行檢測[13]。分子生物學方法特別是RT-PCR檢測技術(shù)具有快速、簡便和準確等優(yōu)點,在禽流感的診斷及大規(guī)模監(jiān)測過程中應(yīng)用廣泛[14]。由于AIV感染動物后具有相似的臨床癥狀,混合感染的現(xiàn)象也普遍存在,所以在日常診斷中難以及時準確地對其進行鑒別確診。近年來,隨著分子生物學技術(shù)的發(fā)展,多重PCR技術(shù)的應(yīng)用也越來越多,特別是在禽流感診斷領(lǐng)域,但關(guān)于三重RT-PCR檢測區(qū)分H9與H10亞型AIV混合感染的方法還未見報道。鑒于此,本研究建立了一種可同時檢測H9與H10亞型AIV的三重RT-PCR檢測方法,不僅可以快速準確地鑒別兩種不同亞型AIV,有利于畜牧業(yè)的健康發(fā)展,同時也可為感染人的AIV病原學監(jiān)測提供技術(shù)支撐,具有十分重要的公共衛(wèi)生意義。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 毒株 AIV毒株H1N2、H3N2、H6N2、H9N2、H9N6、NDV、IBV、ARV及ILTV均由廣西獸醫(yī)生物技術(shù)重點實驗室保存;AIV毒株H7N2、H14N5、H15N9和H16N3的cDNA模板由美國賓夕法尼亞州立大學惠贈;AIV毒株H5N2的cDNA模板由美國康涅狄格州立大學惠贈;AIV毒株H2N3、H4N5、H7N2、H8N4、H10N3、H11N3、H12N5和H13N5的毒株或cDNA模板均由香港大學惠贈。

1.1.2 試劑 本實驗所用SPF雞胚購自北京勃林格殷格翰維通生物技術(shù)有限公司。DL1000 DNA Marker、感受態(tài)細胞、PCR產(chǎn)物快速連接載體、膠回收試劑盒及小量質(zhì)粒抽提試劑盒均購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。MLV逆轉(zhuǎn)錄酶、隨機引物、10 mmol/L dNTP、RNA抽提試劑盒、2×PCR Mix及RNA抑制劑均購自寶生物(北京)有限公司。其它試劑均購自商業(yè)公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 引物的設(shè)計及合成 從GenBank中下載已經(jīng)發(fā)表的各種不同亞型禽流感病毒的M基因序列、H9和H10亞型AIV的HA基因的全長序列；應(yīng)用DNAStar軟件對所下載的序列進行比對分析,找出各個基因的特異性保守區(qū)域,用Primer Premier 5.0軟件進行引物設(shè)計,同時結(jié)合Oligo 7分析軟件對引物進行評價；將設(shè)計的引物進行BLAST驗證并進行篩選,選出3對針對M基因、H9和H10亞型AIV HA基因都特異且片段大小合適的引物。引物由寶生物(大連)有限公司合成。引物序列及目的片段大小見表1。

表1 禽流感病毒H9、H10亞型HA和M基因的引物序列

1.2.2 病原RNA/DNA的提取與cDNA合成 參照核酸抽提試劑盒使用說明書，對本研究中所用到的AIV、IBV、NDV和ARV的RNA及ILTV的DNA進行抽提,抽提后的核酸模板用33 μL RNA-free水溶解。RNA模板參照寶生物反轉(zhuǎn)錄試劑盒的說明書進行cDNA的合成,將所有核酸模板置于-30 ℃低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 三重RT-PCR反應(yīng)體系的建立及優(yōu)化 該方法應(yīng)用25 μL反應(yīng)體系:2×PCR Mix 12.5 μL、H9與H10亞型AIV cDNA模板各1 μL；引物M-F、M-R、H9-F、H9-R、H10-F和H10-R (20 pmol/μL)分別加入0.1～1.0 μL,共10個梯度,每個梯度遞增0.1 μL,進行3個引物組合濃度的優(yōu)化,最后用RNA-free補足至25 μL。同時根據(jù)濃度實驗的效果再對退火溫度及反應(yīng)時間進行組合優(yōu)化,最終確定該方法最佳的反應(yīng)體系及條件。

1.2.4 特異性實驗 應(yīng)用上述所建立的三重RT-PCR檢測方法，分別對H1N2、H2N3、H3N2、H4N5、H5N1、H6N2、H7N2、H8N4、H9N2、H9N6、H10N3、H11N3、H12N5、H13N5、H14N5、H15N5、H16N3、NDV、ARV、IBV和ILTV的cDNA/DNA進行檢測,驗證所建立方法的特異性。

1.2.5 標準品的制備 參照文獻[15]中HA全長基因的引物,分別以H9N2與H10N3毒株的cDNA為模板，進行M基因和HA基因的RT-PCR擴增,得到其全長目的片段,并將目的片段分別連接到載體上并送公司進行測序。將插入有H9與H10亞型AIV的HA基因和M基因全長片段并測序正確的重組質(zhì)粒分別命名為M-T、H9-T和H10-T。用商品化的質(zhì)粒抽提試劑盒分別提取含有M-T、H9-T和H10-T的質(zhì)粒,并用微量核酸檢測儀對其濃度進行測定,根據(jù)相關(guān)公式計算樣品相對應(yīng)的拷貝數(shù)；同時將M-T、H9-T與H10-T質(zhì)粒等拷貝數(shù)混合,并將混合好的樣品進行10倍的倍比稀釋,以便獲得M-T、H9-T與H10-T質(zhì)粒DNA濃度均為(5×107)～(5×102)拷貝/μL的標準品。

1.2.6 敏感性實驗 應(yīng)用上述已優(yōu)化的三重RT-PCR檢測方法，對制備的濃度為5×109至5×101拷貝/μL的M-T、H9-T與H10-T質(zhì)粒樣品進行擴增,驗證該檢測方法的敏感性。

1.2.7 臨床樣品檢測 應(yīng)用本實驗所建立的三重RT-PCR檢測方法，對近期從活禽市場采集的152份雞和鴨咽喉及泄殖腔棉拭子樣品的一部分進行PCR檢測鑒定；同時將相同編號的剩余樣品經(jīng)過處理后接種SPF雞胚，進行流感病毒的分離與血清學鑒定,并將鑒定H9與H10亞型AIV為陽性的樣品進行HA基因的序列測定,對所有M基因陽性樣品也進行序列測定。然后將上述方法的檢測結(jié)果進行對比,進而驗證三重RT-PCR檢測結(jié)果的準確性。

2 結(jié)果與分析

2.1 三重RT-PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化

通過對M基因、H9與H10亞型AIV HA基因3對特異性引物濃度比例及擴增溫度、時間等的優(yōu)化,確定三重RT-PCR反應(yīng)的最佳體系為:2×PCR Mix 12.5 μL；H9與H10亞型AIV cDNA共2 μL作為模板；特異性引物M-F和M-R (20 pmol/μL)的加入量為0.6 μL；特異性引物H9-F和H9-R (20 pmol/μL)的加入量為0.7 μL；特異性引物H10-F及H10-R (20 pmol/μL)的加入量為1 μL；用RNA-free水補足至終體積25 μL。通過對退火溫度進行梯度優(yōu)化篩選,確定該反應(yīng)體系的最佳退火溫度為53 ℃。

2.2 特異性實驗結(jié)果

用所建立的三重RT-PCR方法從H9及H10亞型AIV混合樣品分別檢測出3條特異性的條帶,分別為669 bp(通用)、490 bp(H9亞型)及272 bp(H10亞型);對H9N2和H9N6亞型AIV進行PCR檢測，結(jié)果僅出現(xiàn)2條特異性條帶,片段大小分別為669 bp和490 bp;對H10N3亞型AIV進行擴增，只檢測出2條特異性條帶,片段大小分別為669 bp和272 bp;對其它亞型AIV進行PCR檢測，只有1條669 bp的特異性條帶；常見的禽病病原體均未擴增出任何條帶。表明該方法具有良好的特異性。特異性實驗結(jié)果見圖1。

M: DL1000 DNA Marker; 1: H9N2+H10; 2: H9N6+H10; 3: H9N6; 4: H9N2; 5: H10N3; 6: H1N7; 7: H2N3; 8: H3N2; 9: H5N2; 10: H6N2; 11: H7N2; 12: H8N4; 13: H11N2; 14: H12N5; 15: H13N5; 16: H14N5; 17: H15N5; 18: H16N3; 19: IBV; 20: ARV; 21: ILTV; 22: NDV; 23: 陰性對照。

圖1 特異性實驗結(jié)果

2.3 敏感性實驗結(jié)果

應(yīng)用該方法針對(5×107)～(5×102)拷貝/μL的M基因、H9與H10亞型的AIV質(zhì)粒模板進行擴增,結(jié)果顯示,對濃度為(5×107)～(5×102)拷貝/μL的M基因、H9與H10亞型的AIV進行擴增，均有3條明顯的特異性擴增條帶出現(xiàn),片段大小分別為669、490和272 bp;對濃度等于或小于5×103拷貝/μL的M基因、H9與H10亞型AIV進行擴增，均無擴增條帶。由此可見,該方法最低能同時檢測到質(zhì)粒模板量為5×104拷貝/μL的M基因、H9與H10亞型AIV。

2.4 臨床樣品檢測結(jié)果

應(yīng)用所建立的三重PCR方法對從南寧、柳州和防城港不同活禽市場采集到的152份雞和鴨咽喉及泄殖腔拭子樣品進行檢測,結(jié)果顯示：有13份樣品為H9與H10亞型AIV混合感染陽性,陽性率為8.55%;28份樣品能擴增出490 bp的目的條帶,為H9Nx AIV,陽性率為18.42%;6份樣品能擴增出272 bp的目的條帶,為H10Nx AIV,陽性率為3.95%;其余有18份只有669 bp的目的條帶,為除H10Nx和H9Nx外的其它亞型禽流感病毒。部分活禽市場棉拭子樣品PCR檢測的結(jié)果見圖3。上述樣品檢測結(jié)果與經(jīng)典的雞胚病毒分離鑒定,及其HA基因和M基因測序結(jié)果100%相符。

M: DNA標準DL1000; 1: 5×107拷貝/μL; 2: 5×106拷貝/μL; 3: 5×105拷貝/μL; 4: 5×104拷貝/μL; 5: 5×103拷貝/μL; 6: 5×102拷貝/μL; 7: 陰性對照。

圖2 敏感性實驗結(jié)果

M: DNA標準DL1000; 20: H10亞型AIV陽性產(chǎn)物; 4、13、16、18: H9亞型AIV陽性產(chǎn)物; 5: H9與H10亞型AIV的陽性產(chǎn)物; 2、7、11、14:其它亞型AIV的陽性產(chǎn)物;其余為陰性產(chǎn)物。

圖3 部分臨床樣品的檢測結(jié)果

3 討論

自上世紀90年代H9亞型AIV在中國被發(fā)現(xiàn)以來,該亞型病毒已經(jīng)在全國各個養(yǎng)殖區(qū)流行。它不僅給中國的家禽業(yè)帶來了嚴重的經(jīng)濟損失[16],而且H9N2亞型AIV還可以直接感染人,迄今其直接感染人的病例還在不斷出現(xiàn)。研究表明H10亞型AIV對家禽呈現(xiàn)低致病性,但是其可以跨越種屬屏障直接感染人[17]。AIV的監(jiān)測結(jié)果表明在我國流行的H10亞型禽流感病毒組合包括H10N3、H10N4、H10N5、H10N7、H10N8和H10N9[18]。AIV在感染宿主后,還可再次感染其它不同亞型AIV,不同亞型和來源的AIV片段在宿主體內(nèi)可能會發(fā)生基因重組,進而產(chǎn)生新的重組毒株，包括高致病性的H5N6和H7N9亞型AIV以及感染人的H10N8亞型AIV等[19]。近年來,這些“新毒株”已經(jīng)對家禽生產(chǎn)及人類公共衛(wèi)生的安全構(gòu)成了嚴重威脅,從而引發(fā)了國內(nèi)外科學家對H9與H10亞型AIV的極大關(guān)注和深入研究。

近年來,我們持續(xù)多年對廣西地區(qū)家禽中LPAIV的流行情況進行了監(jiān)測,發(fā)現(xiàn)廣西家禽中LPAIV感染比例比較高的是H9亞型AIV, H10亞型AIV也經(jīng)常在鴨中被檢測到,該結(jié)果與華東地區(qū)等地區(qū)LPAIV的監(jiān)測結(jié)果[20-22]基本一致。由于LPAIV在家禽體內(nèi)多以混合感染的形式存在,且多數(shù)病毒對家禽的致病性不強,臨床癥狀及剖檢病變極其相似,采用肉眼觀察和常規(guī)的方法難以進行快速準確的鑒別診斷。H9與H10亞型AIV不僅在各種家禽中廣泛流行,還不斷出現(xiàn)直接感染人的病例,已經(jīng)嚴重威脅人類公共衛(wèi)生安全。目前,利用傳統(tǒng)的病毒分離及血清學鑒定方法對H9與H10亞型AIV的混合感染進行檢測，不僅耗時而且準確性也難以保證,迫切需要建立一種能夠在較短時間內(nèi)快速有效地檢測及鑒別H9與H10亞型AIV的方法。

本研究通過軟件設(shè)計針對H9與H10亞型AIV HA基因及M基因的特異性引物,經(jīng)過對不同引物組合進行實驗篩選，得到擴增效果較好的1個引物組合；然后繼續(xù)對反應(yīng)體系中的引物濃度、引物之間的比例、退火溫度和擴增時間進行優(yōu)化,最終建立了可同時檢測H9與H10亞型AIV的方法。其特異性驗證結(jié)果表明該方法只能特異性地擴增出H9與H10亞型AIV的HA基因及M基因,不能檢測出其它亞型AIV的HA基因及其它常見家禽病原的核酸。敏感性實驗結(jié)果表明該方法能檢測到最低濃度為5×104拷貝/μL的3種質(zhì)粒的模板。另外,對從不同地區(qū)采集的152份臨床樣品的檢測結(jié)果也表明其結(jié)果與病毒分離及測序結(jié)果完全相符。綜上所述,本研究已經(jīng)成功建立了一種能夠同時檢測H9與H10亞型AIV的三重RT-PCR方法,1次PCR反應(yīng)便可同時確定樣品中H9與H10亞型AIV的混合感染及單一感染情況；該方法還具有特異性強、快速簡便及易于操作等優(yōu)點,十分適于在基層單位應(yīng)用推廣,可為H9與H10亞型AIV的監(jiān)測及其防控提供技術(shù)支撐。