崔月貞，郝興順*，魏芳勤，張春輝，王曉娥，陳永剛，蒙天竣，李 旭

(1.陜西省漢中市農(nóng)業(yè)科學研究所，陜西 漢中 723000；2.甘肅省慶陽市西峰區(qū)農(nóng)業(yè)技術推廣中心，甘肅 慶陽 745000)

魔芋為多年生草本植物，因富含葡甘露聚糖，故其具有重要的藥用和保健功效，成為重要的經(jīng)濟作物之一[1]，在國內(nèi)外市場潛力巨大,具有廣闊的開發(fā)應用前景[2]。隨著魔芋生產(chǎn)規(guī)模的擴大、企業(yè)數(shù)量的增加和產(chǎn)業(yè)鏈的延伸，魔芋產(chǎn)業(yè)成為云南、貴州和陜西等地農(nóng)民脫貧致富奔小康和地方財政增收的骨干經(jīng)濟項目[3-4]。

陜西省秦巴山區(qū)為我國最大的魔芋主產(chǎn)區(qū)域之一，而漢中位于秦巴腹地，該地海拔約500 m，屬亞熱帶濕潤季風性氣候，年降水量800～1000 mm，年均氣溫約14 ℃，土壤疏松肥沃，適宜魔芋半野生生活習性，是大力發(fā)展綠色、無公害魔芋產(chǎn)業(yè)的天然理想場所[5-6]。但是,近年來隨著秦巴山區(qū)魔芋種植面積的不斷擴大,重茬嚴重，導致土傳性病害嚴重發(fā)生，特別是魔芋白絹病持續(xù)加重，造成魔芋減產(chǎn)20%～40%[7]，且一直呈上升趨勢，嚴重影響了病魔芋產(chǎn)量和經(jīng)濟效益，成為制約秦巴山區(qū)魔芋生產(chǎn)發(fā)展和產(chǎn)業(yè)化開發(fā)的主要因素之一[8]。目前，關于湖北、云南和貴州等地區(qū)的魔芋白絹病原菌生物學特性、分類地位和藥劑防治等均有相關研究[9-10]，而關于秦巴漢中魔芋白絹病的研究較少。因此，本研究擬對分離自秦巴漢中魔芋白絹病病原菌進行形態(tài)觀察及16 S rDNA序列鑒定，并對其進行生物學特性測定，以期為秦巴山區(qū)該病害的診斷和綜合防治提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試魔芋病樣于2018年采自陜西漢中種子魔芋種植區(qū)。供試培養(yǎng)基為馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基(PDA)。供試魔芋苗為盆栽條件下1年齡的繁育苗，品種為花魔芋(Amorphophalluskonjac)。

1.2 試驗方法

1.2.1 病原菌的分離與致病性測定 采用常規(guī)組織分離法，選取具有癥狀典型的新鮮魔芋標本，從病斑、病健交界處用刀片切取約0.5 cm2的病組織塊，75%乙醇消毒10 s，然后0.1%的升汞消毒1 min，再用無菌水清洗3次后置于平板上培養(yǎng)，對分離物進行純化培養(yǎng)和4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

致病性測定：采用致傷接種法，將魔芋種子播種于直徑25 cm的塑料花盆中，在溫度為20～30 ℃的室內(nèi)培育植株至4葉時，選用健康長勢均勻的魔芋植株，用消毒后的昆蟲針在莖基部制造微傷口，將分離物在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)5 d后打成直徑6 mm的菌餅接種于傷口處，以無菌平板培養(yǎng)基為對照，保濕48 h，室溫培養(yǎng)，3次重復，連續(xù)觀察魔芋植株發(fā)病情況并記錄數(shù)據(jù)。出現(xiàn)典型癥狀后對發(fā)病植株進行再分離，按照柯赫氏法則[11]確定病原菌。

1.2.2 病原菌的形態(tài)學和16 S rDNA-ITS序列分析鑒定 病原菌的形態(tài)學鑒定：將菌株接于PDA培養(yǎng)基上25 ℃培養(yǎng)10～15 d觀察菌絲和菌核，并在顯微鏡下拍照[12]。

16 S rDNA-ITS 序列分析：提取病原菌基因組DNA，將病原菌接種于PDA液體培養(yǎng)基，于27 ℃、180 r/min搖床振蕩培養(yǎng)5～6 d后收集菌絲，稱取0.1 g至研缽，加入0.3 mL 10%(w/v)的Chelex-100無菌溶液，充分研磨后，轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管，在旋渦混合器上振蕩5 s后沸水浴10 min ，冷卻至室溫后12000 r/min離心10 min，取上清液可作為PCR擴增模板，或-20 ℃保存?zhèn)溆?。擴增引物為ITS1和ITS4，擴增條件為：95 ℃預變性5 min，95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸8 min，30個循環(huán)；最后在72 ℃下延伸10 min，終止反應。50 μL擴增反應體系：2×Power Taq Mixture 25.0 μL，ITS1和ITS4(10 μmol/L)各2.0 μL，DNA模板 2.0 μL，ddH2O 19.0 μL，0.8%凝膠電泳檢測。將具有特異性條帶的擴增產(chǎn)物送至北京華大基因生物有限公司進行測序，將測序結(jié)果在GenBank數(shù)據(jù)庫中進行比對并構建系統(tǒng)發(fā)育樹，確定該病原菌的分類學地位。

1.2.3 生物學特性測定 將病原菌分別置于不同溫度、pH值、碳源和氮源條件下培養(yǎng)，測量菌落直徑，具體方法參考文獻[13]。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析 采用Clustal X 1.8 和Mega 4.0 軟件構建系統(tǒng)發(fā)育樹，采用SPSS 19.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，采用Excel 2010制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 田間癥狀

田間發(fā)病初期，魔芋莖基部出現(xiàn)水漬狀病斑，且呈不規(guī)則下陷，可在病斑周圍土壤中長出放射狀的白色菌絲，病斑漸漸呈淺褐色腐爛流水，后期深褐色組織逐漸軟腐下陷，引起植株倒苗死亡。

2.2 病原菌的分離及致病性測定

選取多個具有典型癥狀的病斑進行分離培養(yǎng)，共得到3株真菌分離物，依次編號為M1、M2和M3，對其進行致病性測定，用針刺接種法分別回接到健康魔芋植株上，5～6 d后，M3開始發(fā)病，癥狀與田間癥狀一致，對照無癥狀(圖1)。根據(jù)柯赫氏法則，從病斑處再次分離病原物并接種測定，確定菌株M3為魔芋白絹病致病菌，并對其進行后續(xù)研究。

2.3 病原菌的形態(tài)學鑒定

病原菌M3在PDA平板上25 ℃培養(yǎng)4 d后，菌落近圓形，初為白色放射狀菌絲發(fā)達，背面呈淡淺黃色，5 d后開始形成菌索，初為淺黃色，漸漸形成菜籽狀菌核，直徑為1.2～2.3 mm，顏色逐漸加深，至茶褐色，具有蘑菇氣味。電子顯微鏡下，菌絲具有隔膜，多在分支處(圖2)。

2.4 基于rDNA-ITS序列的系統(tǒng)發(fā)育學分析

提取病原菌M3的基因組DNA，經(jīng)PCR擴增和測序，獲得rDNA-ITS序列為553 bp，所測序列在GenBank中進行同源序列比對，下載相似性99%以上的序列，經(jīng)過多重序列比較后，構建了系統(tǒng)發(fā)育樹，菌株M3與羅耳阿太菌Atheliarolfsii(KY640625.1)序列相似性為100%，且發(fā)育樹聚在一起(圖3)，結(jié)合形態(tài)學特征，進一步鑒定病原菌M3為羅耳阿太菌Atheliarolfsii。

圖1 魔芋白絹病癥狀及致病性測定

圖2 病原菌M3形態(tài)特征

圖3 病原菌M3系統(tǒng)發(fā)育樹

2.5 病原菌的生物學特性

2.5.1 不同溫度對病原菌菌絲生長的影響 病原菌M3的生長溫度為8～36 ℃，5～28 ℃時病原菌隨著溫度的升高，生長速度不斷加快，28 ℃時達到最大值，菌落平均直徑達8.49 cm，28 ℃以后菌落生長顯著下降(P<0.05)。由此可知，病原菌M3的最適生長溫度為26～28 ℃(圖4)。

圖4 溫度對菌株M3菌絲生長的影響

2.5.2 不同pH值對病原菌菌絲生長的影響 病原菌M3在pH值為4～11的培養(yǎng)基上均可生長，菌落直徑在pH=7時最大，其次為pH=8，菌落直徑分別為7.65 cm和7.51 cm，顯著大于其他pH值的培養(yǎng)基(圖5)。

圖5 不同pH值對菌株M3菌絲生長的影響

2.5.3 不同碳源對病原菌菌絲生長的影響 病原菌M3的最適碳源為麥芽糖，菌落生長速度最快，直徑達8.28 cm，顯著大于其他處理；其次為麥芽糖和蔗糖，菌落直徑分別為7.33 cm和7.24 cm，兩者之間差異不顯著(P>0.05)；其他碳源對病原菌生長影響的順序為果糖>糊精>可溶性淀粉>乳糖，其中果糖和糊精之間差異不顯著(P>0.05)(圖6)。

圖6 碳源對菌株M3菌絲生長的影響

2.5.4 不同氮源對病原菌菌絲生長的影響 病原菌M3的最適氮源為酵母粉，菌落直徑達7.09 cm，顯著大于其他處理(P<0.05)；其次為蛋白胨和硫酸銨，菌落直徑分別為5.85 cm和5.81 cm，兩者之間差異不顯著；其他碳源對菌落生長影響的順序為牛肉膏>硝酸鉀>硝酸銨，其中牛肉汁和硝酸鉀之間差異不顯著(圖7)。

圖7 氮源對菌株M3菌絲生長的影響

3 討論

在植物病原菌分類和鑒定應用中，傳統(tǒng)鑒定方法與基因組DNA序列分析的結(jié)合，可極大提高植物病原物種類鑒定的準確性[14]，因此本研究結(jié)合形態(tài)學觀察和16 S rDNA-ITS序列分析，將菌株M3鑒定為羅耳阿太菌Atheliarolfsii，屬于半知菌亞門，其無性態(tài)為齊整小核菌Sclerotiumrolfsii[15]，與胡紅杏[16]、李利軍[17]等的研究結(jié)果一致，這表明云南、湖北和陜西等地分離獲得的病原菌為同一分類地位的菌株，暫時還未發(fā)現(xiàn)新的生理小種，但多位學者分離獲得的均為無性態(tài)Atheliarolfsii、為何不易分離到有性態(tài)齊整小核菌，原因還有待進一步探究。

本研究發(fā)現(xiàn)，白絹病病原菌最適生長pH值為7，碳源利用以麥芽糖最好、乳糖最差，氮源利用以酵母粉最好、硝酸銨最差，這與已報道的湖北該菌最適pH值為4～5，最適碳源為可溶性淀粉，最適氮源為硝酸銨的結(jié)果[16]不一致，這可能與地域差異或菌株自身適應性有關，但具體原因還有待一步分析。陜西安康白絹病病原菌最適生長溫度為30 ℃，最佳pH值為7[17]，這與本研究結(jié)果基本一致，原因可能在于安康和漢中同為秦巴山區(qū)病原菌生物學特性相似。

嚴凱[18]和廖文月[19]等選用傳統(tǒng)化學農(nóng)藥代森錳鋅、氯溴異氰尿酸和甲基硫茵靈等對魔芋白絹病進行了防效試驗，但近年來農(nóng)業(yè)部大力推進化肥農(nóng)藥雙減，積極探索資源節(jié)約、環(huán)境友好的現(xiàn)代農(nóng)業(yè)發(fā)展之路[20]，而現(xiàn)代生物農(nóng)藥即微生物農(nóng)藥、植物源農(nóng)藥、抗生素類農(nóng)藥和農(nóng)藥增效劑成為必然選擇，因此，下一步有必要對魔芋白絹病進行現(xiàn)代生物農(nóng)藥的篩選應用。

4 結(jié)論

本文通過形態(tài)學鑒定和16 S rDNA-ITS序列分析鑒定，菌株M3為半知菌亞門羅耳阿太菌Atheliarolfsii，科學準確地鑒定了秦巴山區(qū)魔芋白絹病病原菌的分離地位。并明確了菌株M3的最適生長溫度為28 ℃、最適pH值為8、最適碳源為麥芽糖、最適氮源為酵母粉等生物學特性，這為該病害的綠色防控和綜合治理提供了科學依據(jù)。