鄧海濱 阮小蕾

摘要? ? 為建立一種在生產應用中快速簡便的CMV檢測方法，應用膠體金標記技術和免疫層析原理，研制出一種針對廣東煙區(qū)黃瓜花葉病毒病的快速檢測試紙條。檢測結果表明，該試紙條檢測病毒的靈敏度為1 g/103 mL。對煙草上危害嚴重的其他4種病毒均無特異性反應。用試紙條對育苗棚煙株進行隨機檢測，結果與RT-PCR檢測結果相符率為90%。

關鍵詞? ? 膠體金試紙條;黃瓜花葉病毒;廣東煙區(qū)

中圖分類號? ? S435.72? ? ? ? 文獻標識碼? ? A

文章編號? ?1007-5739（2020）08-0099-03? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?開放科學（資源服務）標識碼（OSID）

Abstract? ? In order to establish a rapid，specific and simple method for detection of cucumber mosaic virus，using colloid gold labeling technique and immunochromatography principle，rapid test strip for CMV in Guangdong tobacco area were developed.The test results showed that the sensitivity of the test strip to virus detection was 1 g/103 mL.None of the other 4 viruses，which were seriously harmful to tobacco，had specific reaction.The test strip was used to test the tobacco seedlings of the seedling shed randomly，and the result was 90% in accordance with the results of RT-PCR.

Key words? ? colloid gold strip;CMV;Guangdong tobacco area

黃瓜花葉病毒（cucumber mosaic virus，CMV）屬于雀麥花葉病毒科（Bormoviridae）黃瓜花葉病毒屬（Cuucmovirus）[1]。其寄主范圍特別廣泛，能侵染100科超過 1 200 種的單子葉和雙子葉植物[2]。CMV是引起番茄花葉病、煙草花葉病等的主要病原。在很多寄主中，CMV還可以與其他病毒協(xié)生，加重病毒的致病性[3]。因其寄主范圍的普遍性與引起病害的重要性，CMV已成為全球最重要的植物病毒之一。

快速、準確地檢測病毒，對提高煙葉生產效益具有重要意義。防治CMV主要采用抗病毒育種和生產無毒種苗等方法[4-5]。目前病毒的檢測主要通過電子顯微鏡觀察、ELISA和PCR等方法[6]。在實際應用中，電鏡檢測和PCR需要有昂貴的儀器;ELISA耗時很長。因此，在煙葉生產實踐上應用這些方法進行病毒檢測具有局限性[7]。膠體金免疫層析技術操作簡單、靈敏，無需特殊設備便可大規(guī)模檢測[8]，廣泛應用于食品安全監(jiān)督、動植物檢疫等領域[9-14]。

為了滿足基層生產單位針對煙草、蔬菜上CMV的快速檢測需求，本研究通過構建廣東煙草CMV的單克隆抗體，利用雙抗夾心法，研制出可在10 min內同時快速定性檢測CMV的膠體金試紙條。

1? ? 材料與方法

1.1? ? 試驗材料

1.1.1? ? 試劑及器材。氯金酸、兔抗鼠二抗[15-16]，購自Sigma公司;檸檬酸三鈉（分析純）、BSA，購自廣州精科生物科技有限公司;試驗用水，電阻率 ≥18.2 MΩ，為經超純水裝置凈化的二次去離子水。RNAprep Pure植物總RNA提取試劑盒[15，17]，由天根生化科技（北京）有限公司生產。Protein A-Agarose親和柱，購自GE Healthcare公司。硝酸纖維素膜、玻璃棉、支持板、玻璃纖維、吸水紙，購自德國S.S公司。

1.1.2? ? 毒源。PVY、TMV、馬鈴薯A病毒（potato virus A，PVA）、煙草蝕紋病毒（tobacco etch virus，TEV）、番茄斑萎病毒（TS-WV），來自華南農業(yè)大學植物病毒研究室。CMV，為華南農業(yè)大學植物病毒研究室保存的的普通株系[15]，摩擦接種并保存于系統(tǒng)侵染寄主三生煙（Nicotiana tabacum var. Samsun）上。

1.1.3? ? 引物序列。以CMV的CP基因為模板設計引物，進行RT-PCR擴增，引物序列如下：

擴增片段長度為250 bp。

1.1.4? ? 煙苗。本實驗室育苗棚常規(guī)培育煙苗100株，品種為K326。采自廣東省各煙區(qū)疑似感染病毒樣本150份，品種為K326和云煙87。

1.2? ? 試驗方法

1.2.1? ? CMV抗原的制備。CMV粒子的提純方案采用文端志等[18]的方法進行。

1.2.2? ? CMV單克隆抗體的制備。由提純的病毒顆子作為抗原免疫BALB/c雌性小鼠。72 h后取免疫小鼠的SP2/0細胞與脾細胞，通過PEG[19]法融合。經過培養(yǎng)、篩查，分別獲得表達3種病毒單克隆抗體的雜交瘤細胞株。腹水的制備參照尚海麗等研究方法[20]。采用Protein A-Agarose親和柱進行腹水的親和純化，參照產品說明書使用方法，將純化后的單抗于-80 ℃冰箱中保存，待用。

1.2.3? ? 膠體金的制備。采用檸檬酸三鈉還原法[21]制備膠體金溶液，所得膠體金溶液粒徑為25 nm。

1.2.4? ? 膠體金的標記。量取20 mL膠體金溶液，將pH值調至8.5，將0.1 mg病毒單克隆抗體攪拌加入，攪拌 時間30 min，再加入終濃度20%的PEG-20000穩(wěn)定未結合的膠體金顆粒，在8 700 r/min條件下離心30 min，去除上清，再用金標緩沖溶液定容至 1 mL，于4 ℃條件下保存，待用。

1.2.5? ? 金標墊的制備。在金標墊上均勻涂布標記好的膠體金溶液，將此金標墊放置于37 ℃條件下烘干120 min，待用。

1.2.6? ? 質控線和檢測線的包被。用硝酸纖維素膜分別包被兔抗鼠IgG二抗和病毒單克隆抗體，作為質控線和檢測線，放置于37 ℃條件下烘干120 min，待用。

1.2.7? ? 病毒檢測試紙的制備。在背襯板上依次粘貼已制備好的硝酸纖維素膜、金標墊、樣品墊和吸水紙，并用切條機切割成8 mm的條，裝入卡殼，封裝于鋁箔袋中（此鋁箔袋內事先裝有干燥劑）。放置于4～28 ℃條件下保存，待用。

1.2.8? ? 樣品檢測和判定標準。取感染病毒的煙草葉片，加入PBS液磨碎。取3～4滴混合液緩慢滴加到加樣孔中，放平試紙卡，160 s內觀察結果。判定標準：若質控線處不出現(xiàn)顯色條帶則表示試紙條失效。若試紙條上除質控線出現(xiàn)條帶，檢測線處也出現(xiàn)一顯色的條帶，則為陽性結果。若在試紙條上只有質控線出現(xiàn)一條顯色的條帶，檢測線無條帶，則為陰性結果。

1.2.9? ? 靈敏度試驗。將含有CMV的植物葉片研磨，分別制備成1 g/10 mL、1 g/102 mL、1 g/103 mL、1 g/104 mL、1 g/105 mL、1 g/106 mL的檢測液。取多重病毒檢測試紙條進行檢測，測試其靈敏度。

1.2.10? ? 特異性試驗。用本研究開發(fā)的病毒檢測試紙條分別檢測TMV、PVY、PVA、TSWV，測試其檢測病毒的特異性。

1.2.11? ? 穩(wěn)定性試驗。將制備好的CMV快速檢測試紙密封后在室溫（10～37 ℃）下保存，并在第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12個月后取出，分別檢測陰性和用CMV提純病毒配制的陽性樣品，分析其穩(wěn)定性。

1.2.12? ? 符合率測試。用本研究開發(fā)的病毒檢測試紙條檢測供試煙苗。同時，抽提每株煙苗的總RNA，進行RT-PCR擴增，檢測其是否攜帶病毒。比較2種方法檢測結果的符合率。

2? ? 結果與分析

2.1? ? 分泌病毒單抗的雜交瘤細胞株獲得

取免疫小鼠脾臟細胞和對數(shù)生長期的SP2/0鼠骨髓瘤細胞，通過聚乙二醇融合獲得雜交瘤細胞[15-16]，雜交瘤細胞經HAT培養(yǎng)基篩選和培養(yǎng)12 d。用作包被抗原的是感病的煙草組織粗提液，檢測雜交瘤細胞培養(yǎng)上清液中的抗體采用間接 ELISA 方法[15，17]，最終獲得13株能穩(wěn)定分泌單克隆抗體的雜交瘤細胞株。

2.2? ? 單抗腹水制備、亞類鑒定

分別取分泌不同病毒的雜交瘤細胞注入已用降植烷處理的8周齡BALB/c小鼠腹腔內[15]，7～10 d后收集單抗腹水。腹水抗純化后的IgG含量為1.87～3.35 mg/mL。采用 Sigma公司的抗體類型和亞類鑒定試劑盒鑒定單克隆抗體的抗體類型及亞類[16-17]。鑒定結果表明，13株CMV中有8株 IgG1、3株IgG2a、2株IgG2b[15]。

2.3? ? 靈敏度試驗

本文制備的病毒試紙條檢測CMV最低濃度1 g/103 mL，結果見圖1。

2.4? ? ?特異性試驗

本研究開發(fā)的病毒試紙條檢測目標病毒的特異性好，結果見圖2，可以看出，試紙條分別檢測CMV、TMV、PVY、PVA、TSWV的測試結果。

2.5? ? 穩(wěn)定性試驗

制備好的CMV膠體金試紙條分別在第 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12個月后取出檢測陰性及陽性樣品，檢測線和質控線的顯色無明顯變化，表明試紙穩(wěn)定性很好。

2.6? ? 符合率測試

分別在廣東南雄和始興煙草育苗大棚取樣，對比試紙條和RT-PCR 2種檢測方法的陽性檢出率，結果如表1所示?？梢钥闯?，本研究研制的試紙條對目標病毒的檢出與RT-PCR檢出結果的符合率，南雄取樣點的CMV為90%，始興取樣點的CMV為97.7%，說明試紙條同室內RT-PCR檢測方法相比具有較高的符合率。

3? ?結論與討論

由于雙抗體夾心免疫層析法對抗體的要求較苛刻，需要針對2個不同位點的抗體才能用于配對檢測[22]。從13株單克隆抗體中只篩選配對成功1對抗體，能滿足檢測靈敏度需要。因此，在后續(xù)研究中可繼續(xù)進行免疫，以篩選出多株單克隆抗體，提高其配對幾率。

本研究制備的CMV膠體金檢測試紙條成本低廉，操作簡便、快速，不需要特殊試驗條件，檢測結果易于肉眼判斷。其對目標病毒的檢測特異性良好，敏感度達到1 g/103 mL，填補了國內CMV膠體金快速檢測試劑的空白。在進行大量田間樣品檢測試驗后確定本試紙能滿足對田間樣本快速、準確、靈敏的檢測要求，并且操作簡單方便，適合基層生產單位在煙草漂浮育苗期快速、大量檢測CMV感染煙株，對減少CMV的感染、切斷CMV的傳播途徑、篩選培育無病毒壯苗具有重要作用。

本研究制備的試紙條與RT-PCR檢測的符合率略低，這是由于該樣品含有的病毒量較低的緣故，但其高于90%的符合率完全可以替代進口產品使用。隨著煙草及各種主栽作物綠色防控重大項目的開展，減少化學農藥使用量、降低作物農藥殘留成為目前煙草生產目標。本研究針對廣東煙區(qū)CMV病毒病研制的快速檢測試紙，可以在煙草苗期通過快檢技術篩查出可能的毒源，從而減少煙苗帶毒移栽，可以降低植株的田間帶毒率，減少田間抗病毒農藥使用，減少經濟損失，具有明顯的經濟和社會效益。

4? ? 參考文獻

[1] PALUKAITIS P，ROOSSINEK M J，DIETZGEN R G.Cucumber mosaic virus advances in virus research[J].Ady Virus Res，1992，41：281-348.

[2] 李華平，胡晉生，范懷忠.黃瓜花葉病毒的株系鑒定研究進展[J].中國病毒學，1994（9）：187-194.

[3] 王威麟，張昊，于祥泉，等.侵染西瓜的5種病毒ZYMV、WMV、TMV、SqMV和CMV的多重RT-PCR檢測體系的建立與檢測應用[J].植物病理學報，2010，40（1）：27-32.

[4] 馮長春.攀枝花煙草病毒病綜合防治技術探索與研究[D].北京：中國農業(yè)科學院，2010.

[5] 侯娜.東方百合脫毒技術的研究[D].楊凌：西北農林科技大學，2008.

[6] 婁虎，徐熔，王海竹，等.植物病毒病檢測及防治的研究進展[J].江蘇農業(yè)科學，2017，45（24）：25-31.

[7] 張京宣，曹秀芬，宋濤，等.植物病毒檢測技術研究進展分析[J].北京農業(yè)，2011（10）：79-80.

[8] PAEK S H，LEE S H，CHO J K，et al.Development of rapid one-step immunochromatographic assay[J].Methods，2000，22（1）：53-60.

[9] WANG Y H，X R LI，WANG G X，et al.Development of an immunochro-matographic strip for the rapid detection of toxoplasmagondii circulating antigens[J].Parasitology International，2011，60：105-107.

[10] KUSANO N，IWANAMI T，NARAHARA K，et al.Production of monoc-lonal antibodies specific for the recombinant viral coat protein of Apple stem grooving virus-citrus isolate and theirapplication for a simple，rapid diagnosis by animmunochromatographicassay[J].Journal of Virological Methods，2014，195：86-91.

[11] 劉潔，牟林琳，何文輝，等.犬細小病毒膠體金檢測試紙條的制備與初步評價[J].中國獸藥雜志，2014，48（3）：35-37.

[12] 王麗哲，趙瑜，唐慧林，等.新霉素半定量膠體金試紙條的研制[J].食品科學，2014，35（8）：309-312.

[13] 王喜亮，金秀娥，李奎，等.膠體金試紙條半定量檢測雞蛋中磺胺嘧啶殘留[J].中國獸醫(yī)學報，2008，28（8）：957-961.

[14] 姜金慶，楊雪峰，王自良，等.克倫特羅和萊克多巴胺多殘留膠體金免疫層析試紙條的研制[J].畜牧獸醫(yī)學報，2013，44（1）：87-94.

[15] 阮小蕾，鄧海濱，王曉賓，等.多重煙草病毒膠體金檢測試紙條的研制及應用[J].煙草科技，2018，51（10）：33-38.

[16] 宋革，郭玉雙，饒黎霞，等.馬鈴薯Y病毒單克隆抗體的制備及其檢測應用[J].浙江大學學報（農業(yè)與生命科學版），2016，42（5）：517.

[17] 劉潔，牟林琳，何文輝，等.犬細小病毒膠體金檢測試紙條的制備與初步評價[J].中國獸藥雜志，2014，48（3）：35-37.

[18] 文端志，吳方城，彭學賢.西葫蘆黃化皺縮病CMV毒株的提純及其理化性質的研究[J].微生物學報，1983，23（3）：247-250.

[19] 劉秀梵.單克隆抗體在農業(yè)上的應用[M].合肥：安徽科學技術出版社，1994.

[20] 尚海麗，周雪平，吳建祥.免疫斑點法和免疫捕獲RT-PCR檢測黃瓜綠斑駁花葉病毒[J].浙江大學學報（農業(yè)與生命科學版），2010，36（5）：485-490.

[21] 宋香寧.檸檬酸鈉還原法制備金納米粒子的研究[D].長春：吉林大學，2007.

[22] 吳峰，呂琦，袁航，等.煙草花葉病毒快速檢測方法的建立及應用[J].云南大學學報（自然科學版），2012，34（增刊1）：110-115.