劉青 李悅欣 趙德剛 趙懿琛

摘? ? 要： 為了解貴州省折溪‘小黃姜中內(nèi)生菌資源，采用涂布法從折溪‘小黃姜中分離、純化出內(nèi)生細菌，通過形態(tài)學特征結(jié)合分子生物學手段確定其分類地位。結(jié)果表明，從折溪‘小黃姜中共分離出5株不同的內(nèi)生菌，命名為GrsB1、GrsB2、GrsB3、GrsB4、GrsB5，其中GrsB1屬于芽孢桿菌科、微小桿菌屬（Exiguobacterium），其他4株菌屬于腸桿菌科，分別屬于拉烏爾菌屬（Raoultella）、腸桿菌屬（Enterobacter）、埃希氏菌屬（Escherichia）、沙雷氏菌屬（Serratia），腸桿菌科數(shù)量最多。雖然分離出的內(nèi)生菌數(shù)量較少，但菌株種屬分布范圍較大，可以為小黃姜內(nèi)生菌資源的進一步研究提供理論基礎。

關鍵詞： 小黃姜; 內(nèi)生細菌; 分離; 鑒定

Abstract： In this study， In order to understand the endophyte resources of ‘Small yellow ginger （Zingiber officinale Roscoe） in Zhexi， Guizhou province， a coating method was used to isolate and purify endogenous bacteria from ‘Small yellow ginger ， and its classification status was determined by morphological characteristics combined with molecular biological methods. The results showed that five endophytes were isolated from ‘Small yellow ginger， named Grsb1， Grsb2， Grsb3， Grsb4 and Grsb5， Grsb1 belongs to Bacillus ， Exiguobacterium. The other four strains belong to raoultella， enterobacter， Escherichia and Serratia in Enterobacteriaceae respectively， the largest number of Enterobacteriaceae. The number of endophytes isolated in this study is small， but the distribution of strains is large， which can provide theoretical basis for further research on the endophyte resources of ‘Small yellow ginger.

植物內(nèi)生菌是指其生活史的一定階段或全部階段生活在健康植物各種組織器官內(nèi)部或組織間隙中的微生物[1]。Bacon等[2]研究發(fā)現(xiàn)，食用有內(nèi)生菌的高羊茅會使牛、羊中毒，此后，對植物內(nèi)生菌的研究才引起人們的高度重視。目前在已報道的各種農(nóng)作物以及經(jīng)濟作物中發(fā)現(xiàn)的植物內(nèi)生細菌已經(jīng)超過129種，分別屬于54個屬，主要為假單胞菌屬 （Pseudomonas）、腸桿菌屬（Enterobacter）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、土壤桿菌屬 （Agrobacterium）、克雷伯氏菌屬（Klebsiella）、泛菌屬（Pantoea）、甲基桿菌屬（Methylobacterium）等[3]。用于內(nèi)生菌研究的植物主要是藥用植物[4]、經(jīng)濟作物[5-6]、瓜果[7-8]等，研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)生細菌不僅能促進宿主植物的生長，增強宿主植物對環(huán)境變化的適應性[9-11]，還對植物病原菌有較好的抑制作用[12-13]。

《中藥大辭典》記載，姜是重要的藥食同源植物，具有消炎、散熱、解毒等功效，研究發(fā)現(xiàn)姜中含有的姜精油、姜辣素及黃酮類化合物等化學成分具有抗氧化、抗腫瘤、降血糖等作用[14]，還由于其獨特的辛辣氣味而作為調(diào)料品廣泛應用于食物調(diào)味，具有重要的醫(yī)用價值和經(jīng)濟價值。折溪‘小黃姜（Zingiber officinale Roscoe）是六盤水折溪鄉(xiāng)經(jīng)過長期栽培選育出的優(yōu)良栽培種，屬于姜科姜屬姜種。2000年經(jīng)中科院地理科學與資源研究所鑒定，折溪‘小黃姜為高品質(zhì)生姜，其姜油含量為0.72%，姜辣素含量為2.85%，有機硒為1.20 mg·kg-1，其中姜油和姜辣素含量分別是國內(nèi)其他品種姜的2～3倍[15]。目前對小黃姜的研究主要是栽培技術[16-17]和有效成分提取[18]，對內(nèi)生菌的研究比較少。楚敏等[19]從生姜中分離得到23株內(nèi)生細菌，分為5個屬，周寧[20]從新鮮姜塊中分離得到47株內(nèi)生菌，并且發(fā)現(xiàn)內(nèi)生菌對姜瘟病具有一定的抑制作用，但是關于折溪‘小黃姜內(nèi)生菌資源的研究未見報道。筆者以貴州省六盤水市六枝特區(qū)折溪鄉(xiāng)‘小黃姜為材料，對其內(nèi)生菌進行分離、鑒定，為折溪鄉(xiāng)‘小黃姜內(nèi)生菌資源的進一步研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗材料為取自貴州省六盤水市六枝特區(qū)折溪鄉(xiāng)的折溪‘小黃姜，折溪鄉(xiāng)地處東經(jīng)105°10'～105°15'，北緯26°05'～26°11'，海拔581～2 900 m，年平均氣溫和年平均降雨量適合小黃姜生長。試驗于2018年10月在貴州大學農(nóng)業(yè)生物工程研究院進行。

1.2 方法

1.2.1 內(nèi)生細菌的分離 用水將材料表面的泥沙沖洗干凈，置于陰涼處自然晾干。把姜組織塊切成0.5 cm×0.5 cm的小塊，用0.1%多菌靈溶液浸泡5 min，流水沖洗2 h，分別對其進行編號。在超凈臺進行表面消毒，先用75%的酒精震蕩消毒5～7 min，無菌水沖洗3次，再用0.1%升汞消毒5 min，無菌水沖洗3次，用無菌吸水紙吸干水分，放在超凈臺自然晾干。取100 μL最后一次沖洗的無菌水涂布在LB培養(yǎng)基上，設置3次重復，37 ℃倒置培養(yǎng)3 d，觀察平板上是否有菌落出現(xiàn)，若沒有則說明組織塊表面消毒徹底，后續(xù)試驗中分離得到的細菌均為內(nèi)生細菌。

將表面消毒的組織塊用無菌刀片去皮后切成碎塊，放在無菌研缽中，用無菌的石英砂和質(zhì)量分數(shù)為0.85%的氯化鈉溶液充分研磨，用移液槍吸取1 mL上清液進行10倍梯度稀釋，稀釋后的溶液各取100 μL涂布于LB平板上，30 ℃倒置培養(yǎng)2～3 d。待其長出菌落后，挑取不同形態(tài)的菌落分別涂布在新的LB平板上，反復純化，直到整個平板上菌落的形態(tài)完全一致并出現(xiàn)單菌落。挑取單菌落，37 ℃，180 r·min-1過夜搖菌，25%甘油保存。

1.2.2 內(nèi)生細菌的形態(tài)特征與革蘭氏染色 將純化得到的菌株在LB培養(yǎng)基上劃板，37 ℃培養(yǎng)12 h，觀察并登記單菌落的形態(tài)、質(zhì)地、邊緣、顏色、透明度。挑取單菌落革蘭氏染色后，在100倍油鏡下觀察染色情況。

1.2.3 掃描電鏡（SEM）觀察 參照胡春輝等[21]的方法，將冷凍干燥后的樣品進行離子濺射噴金處理后，用掃描電子顯微鏡拍照。

1.2.4 小黃姜內(nèi)生細菌16S rRNA擴增及分子鑒定 挑取單菌落在LB液體培養(yǎng)基中37 ℃、180 r·min-1搖床過夜培養(yǎng)，離心收集菌體，用細菌基因組DNA快速抽提試劑盒進行DNA提取。以細菌通用引物27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）和1492R（5'-TACCTTGTTACGACTT-3'）進行16S rRNA序列擴增。PCR擴增體系（10 μL）：Premix Taq（Takara Taq）5 μL;引物27F（10 μmol·L-1）和1492R （10 μmol·L-1）各0.3 μL;基因組DNA 1 μL ;無菌ddH2O 3.4 μL。擴增條件：94 ℃預變性3 min;94 ℃變性30 s;55 ℃退火30 s;72 ℃延伸2 min;共30個循環(huán)，72 ℃延伸5 min;4 ℃保存，擴增結(jié)束后用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物。將擴出目的條帶的對應模板用高保真酶（Invitrogen）進行擴增，擴增體系（20 μL）：包括10× High Fidelity PCR Buffer 2 μL;50 mmol·L-1 MgSO4 0.8 μL;10 mmol·L-1 dNTP 0.4 μL;引物27F（10 μmol·L-1）和1492R （10 μmol·L-1）各0.4 μL;Hatinum Taq 0.08 μL;基因組DNA 1 μL;無菌ddH2O 14.92 μL。擴增條件：94 ℃預變性2 min，94 ℃變性15 s，55 ℃退火30 s;68 ℃延伸2 min;共30個循環(huán)，68 ℃延伸5 min;4 ℃保存。PCR產(chǎn)物采用Cycle-Pure Kit（D6492-01）（omega）試劑盒進行純化，步驟參照說明書。

純化后的產(chǎn)物送至華大科技（廣州）測序，測序結(jié)果使用Seqman軟件進行序列拼接，在NCBI中進行同源序列比對，用軟件MEGA 7.0采用Neighbor-Joining法構建系統(tǒng)發(fā)育進化樹，初步對細菌進行分子鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 內(nèi)生細菌的分離與初步鑒定

通過革蘭氏染色結(jié)果可以看出，染色后GrsB1菌體呈紫色，GrsB2、GrsB3、GrsB4、GrsB5菌體均呈紅色，因此可以判定GrsB1為陽性菌，其他4株菌均為陰性菌。將分離的菌株在LB固體培養(yǎng)基上劃板，37 ℃過夜培養(yǎng)后觀察其形態(tài)特征，發(fā)現(xiàn)5株菌菌落均為圓形，邊緣規(guī)則，菌落表面濕潤，有光澤，GrsB2和GrsB3無色素產(chǎn)生，其他3種有色素，其中GrsB1初培養(yǎng)時菌落表面為淡黃色，隨著培養(yǎng)時間的加長，慢慢變?yōu)榻瘘S色;GrsB4為淡黃色;GrsB5開始為乳白色，隨著培養(yǎng)時間的延長菌落中間變?yōu)榧t色。形態(tài)特征見表1。

2.2 小黃姜內(nèi)生細菌基因組DNA提取與16S rRNA序列擴增

5株菌株均提取出高質(zhì)量的DNA（圖1），以該DNA為模板進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，均擴增出1 500 bp左右的條帶（圖2），擴增效果較好。

2.3 小黃姜內(nèi)生細菌16s rRNA序列分析

將測序結(jié)果用Blast軟件進行比對分析，找出相似度最高的序列作為同源序列（表2），并構建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖3）。小黃姜內(nèi)生菌16S rRNA序列測序比對，結(jié)果發(fā)現(xiàn)5株菌的16S rRNA與GENEBACK中已知16S rRNA序列最高相似性均在99%以上，其中3株菌的相似度為100%，說明這5株內(nèi)生菌均為已知菌（表2）。分析發(fā)現(xiàn)，5株菌屬于2個科5個屬，GrsB1屬于芽孢桿菌科，GrsB2、GrsB3、GrsB4、GrsB5屬于腸桿菌科，數(shù)量最多是優(yōu)勢菌株，5株菌分別屬于微小桿菌屬（Exiguobacterium）、拉烏爾菌屬（Raoultella）、腸桿菌屬（Enterobacter）、埃希氏菌屬（Escherichia）、沙雷氏菌屬（Serratia）。從系統(tǒng)發(fā)育樹可以看出5株菌聚為兩個大類，GrsB1屬于陽性菌，單獨聚為一支，其余4株菌屬于陰性菌聚為一支。5株菌都單獨聚為一支，說明其遺傳關系較近。

3 討 論

筆者選取貴州省六盤水六枝特區(qū)折溪鄉(xiāng)‘小黃姜為試驗材料，通過嚴格的消毒過程，從材料組織塊中分離得到5株內(nèi)生細菌，通過形態(tài)學鑒定與16s rRNA序列分析，初步鑒定5株內(nèi)生菌屬于2個科5個屬，1個屬于芽孢桿菌科，微小桿菌屬（Exiguobacterium），4個屬于腸桿菌科，分別屬于拉烏爾菌屬（Raoultella）、腸桿菌屬（Enterobacter）、埃希氏菌屬（Escherichia）、沙雷氏菌屬（Serratia），筆者分離得到的5株內(nèi)生菌中腸桿菌科的最多，這與Rohini S[9]的研究結(jié)果一致。筆者在分離內(nèi)生菌過程中以最后沖洗姜塊的無菌水為陰性對照，并未培養(yǎng)出任何細菌，說明操作過程嚴謹，消毒徹底，分離出的細菌均為內(nèi)生細菌。本試驗所用的培養(yǎng)基為培養(yǎng)細菌的LB培養(yǎng)基，因此只分離出‘小黃姜中的內(nèi)生細菌，周寧[20]從大姜中分離出的內(nèi)生菌，除了大量的內(nèi)生細菌外還包括少量的放線菌和內(nèi)生真菌，因此后續(xù)研究會使用多種培養(yǎng)基，以期將放線菌和內(nèi)生真菌分離出來，豐富該材料內(nèi)生菌資源。楚敏[19]從生姜中分離的內(nèi)生細菌包括了5個屬8個種，與本研究的結(jié)果有差異，差異的原因可能是本試驗與后者使用材料的品種、產(chǎn)地、培養(yǎng)基均不同所導致的，另外，折溪鄉(xiāng)‘小黃姜所含的姜精油、姜辣素均高于普通生姜，姜辣素與姜精油都有一定的抑菌效果，對枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌等有不同程度的抑制作用[22]，這可能也是本次試驗中分離得到的內(nèi)生細菌較少的原因。

貴州省六枝特區(qū)種植大量‘小黃姜，但是由于連作和無性繁殖等原因，‘小黃姜體內(nèi)積累大量的病毒病菌，影響其品質(zhì)和口感[23]。廖震[24]利用sRNA 高通量序技術對貴州省六盤水市折溪鄉(xiāng)的小黃姜進行了病毒預測，首次在小黃姜中發(fā)現(xiàn)一個桿狀DNA病毒屬的新病毒，命名為小黃姜桿狀病毒（Zingiber bacilliform virus，ZBV） 。因此，內(nèi)生菌對‘小黃姜病原菌的抑制作用也是接下來重要的研究方向。芽孢桿菌屬在生防菌中有非常大的應用前景[25-26]，傅俊范等[27]從土壤中分離出一株枯草芽孢桿菌，對人參銹腐病有較好的抑制作用，未見微小桿菌對植物病原菌抑菌作用的報道，但其對藍藻具有促生作用[28]，還能夠降解農(nóng)藥殘留，修復環(huán)境污染[29]。陳政[30]的研究表明，腸桿菌屬能夠抑制姜瘟病病原菌的生長，陳濤[31]發(fā)現(xiàn)腸桿菌屬是生姜內(nèi)生菌的優(yōu)勢菌株。粘質(zhì)沙雷氏菌產(chǎn)生的次生代謝物靈菌紅素對煙草花葉病毒具有抑制作用，還能誘導寄主植物產(chǎn)生系統(tǒng)抗性（ISR）[32]。因此，筆者后續(xù)將針對分離的內(nèi)生菌對‘小黃姜的致病菌的抑制作用展開研究，以期找到‘小黃姜的優(yōu)良生防菌株。

另一方面，‘小黃姜是典型的藥食同源植物，內(nèi)生菌與宿主植物共生，能夠產(chǎn)生與宿主植物相同的藥效[33-35]，有文獻報道粘質(zhì)沙雷氏菌產(chǎn)生的靈菌紅素對癌細胞有抑制作用[36]。因此后續(xù)試驗可對內(nèi)生菌的活性成分進行研究，以期找到對人類健康有益的內(nèi)生菌。

綜上所述，筆者從折溪鄉(xiāng)‘小黃姜中分離得到5種內(nèi)生細菌，屬于2個科5個屬，數(shù)量不多，但其所分離菌株的種屬分布范圍較大，為后期拮抗菌株的篩選和活性成分研究奠定了良好的理論基礎。

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