趙麗娜 籍學(xué)偉 王玉華*

1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010110；2.內(nèi)蒙古自治區(qū)藥品檢驗(yàn)研究院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010020

蒙成藥小兒清肺八味丸(蒙名：胡勒森竹崗-8)收載于《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)》蒙藥分冊(cè)第63頁(yè)[1]，是蒙醫(yī)常用兒科用藥，由天竺黃、北沙參、紅花、胡黃連、牛黃、拳參、檀香、麥冬八味藥材制成，具有清肺熱、止咳定喘的功效，用于小兒肺熱、發(fā)燒、咳嗽、氣促、瘟疫熱盛等癥。小兒清肺八味丸現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)只收載了【性狀】及【檢查】項(xiàng)，無(wú)【鑒別】和【含量測(cè)定】項(xiàng)，現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)水平低且不完善。為提高現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，該實(shí)驗(yàn)采用TLC法和HPLC法分別對(duì)小兒清肺八味丸薄層色譜鑒別方法和含量測(cè)定方法進(jìn)行研究，并建立紅花、麥冬[2]、拳參、人工牛黃、胡黃連[3]等五味藥材的薄層鑒別方法及高效液相色譜測(cè)定胡黃連化學(xué)成分的含量測(cè)定方法。

1 儀器與材料

1.1 儀器 戴安U-3000型高效液相色譜儀(美國(guó)戴安公司)；TLC Visualizer薄層色譜數(shù)碼成像系統(tǒng)(杭州漢澤科技有限公司)；KQ-500DE型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；Mettler AE-100型電子天平(萬(wàn)分之一，梅特勒-托利多儀器有限公司)；Sartorius ME 5型電子天平(百萬(wàn)分之一，賽多利斯貿(mào)易有限公司)；DHG-9145A型鼓風(fēng)干燥箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)。

1.2 藥品與試劑 小兒清肺八味丸(烏蘭浩特中蒙制藥有限公司(A公司)，批號(hào)：160814、160815、160816，規(guī)格：2 g /10粒；180403，規(guī)格：1 g /25粒；內(nèi)蒙古蒙藥股份有限公司(B公司)，批號(hào)：1608041、1608042、1608043、1712001，規(guī)格：1 g /25粒；內(nèi)蒙古庫(kù)倫蒙藥有限公司(C公司)，批號(hào)：1609071、1609072、1609073、180316，規(guī)格：1 g /25粒)。

紅花對(duì)照藥材，批號(hào)：120907-201412；麥冬對(duì)照藥材，批號(hào)：121013-201310；沒食子酸對(duì)照品，批號(hào)：110831-201605；豬去氧膽酸對(duì)照品，批號(hào)：100087-201411；膽酸對(duì)照品，批號(hào)：100078-201415；胡黃連苷Ⅰ對(duì)照品，批號(hào)：111727-201702，含量：95.6%；胡黃連苷Ⅱ?qū)φ掌?，批?hào)：111596-201805，含量：93.2%。上述對(duì)照藥材及對(duì)照品均來(lái)自中國(guó)藥品生物制品檢定研究院。

硅膠G、H、GF254、HSG薄層板(煙臺(tái)市化學(xué)工業(yè)研究所、青島海洋化工廠)；德國(guó)Merck薄層層析硅膠粉H型(德國(guó)默克公司)；甲醇為色譜純，其他試劑均為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層色譜鑒別

2.1.1 紅花 取本品粉末2 g，加80%丙酮10 mL，密塞，振搖15 min，濾過(guò)，濾液作為供試品溶液。取紅花對(duì)照藥材約0.5 g，同法制成對(duì)照藥材溶液。另取除紅花藥材外其他七味藥材粉末，按處方比例混合均勻，稱取約1.7 g，同法制成陰性對(duì)照溶液。照薄層色譜法(《中國(guó)藥典》2015版通則0502)[4]試驗(yàn)，吸取供試品溶液、紅花對(duì)照藥材溶液以及陰性對(duì)照溶液各10 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠H薄層板上，以乙酸乙酯-甲酸-水-甲醇(7∶2∶3∶0.4)為展開劑[5-6]，展開，展距為12 cm，取出薄層板，晾干。結(jié)果顯示，供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，且陰性對(duì)照對(duì)測(cè)定沒有干擾。薄層層析圖譜如圖1所示。

2.1.2 麥冬 取本品粉末 2.5 g，加水 30 mL，再加鹽酸 2 mL，加熱回流1 h，冷卻，濾過(guò)，濾液分別用30 mL三氯甲烷振搖提取2次，合并三氯甲烷液，蒸干，殘?jiān)尤燃淄?2 mL使溶解，作為供試品溶液。取麥冬對(duì)照藥材 0.5 g，同法制成對(duì)照藥材溶液。另取除麥冬藥材外其他七味藥材粉末，按處方比例混合均勻，稱取約 2 g，同法制成陰性對(duì)照溶液。照薄層色譜法(《中國(guó)藥典》2015版通則0502)試驗(yàn)，吸取供試品溶液與陰性對(duì)照溶液各 8 μL，麥冬對(duì)照藥材溶液5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-丙酮(4∶1)為展開劑[7]，展開，展距為12 cm，取出薄層板，晾干，以10%硫酸乙醇溶液為顯色劑，均勻噴于薄層板，在105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，在自然光下檢視。結(jié)果顯示，供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，且陰性對(duì)照對(duì)測(cè)定沒有干擾。薄層層析圖譜如圖2所示。

2.1.3 拳參 取本品粉末5 g，加甲醇 20 mL，超聲處理 30 min，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状?5 mL使溶解，作為供試品溶液。取沒食子酸對(duì)照品適量，加甲醇制成濃度為1 mg/mL的溶液，作為對(duì)照品溶液。另取除拳參藥材外其他七味藥材粉末，按處方比例混合均勻，稱取約5 g，同法制成陰性對(duì)照溶液。照薄層色譜法(《中國(guó)藥典》2015版通則0502)試驗(yàn)，吸取供試品溶液與陰性對(duì)照溶液各8 μL、沒食子酸對(duì)照品溶液 5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠HSG薄層板上，以二氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸(5∶4∶1)為展開劑[8]，上行展開約12 cm，取出薄層板，揮干溶劑后置氨蒸氣中熏至斑點(diǎn)顯色清晰。結(jié)果顯示，供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的清晰斑點(diǎn)，且陰性對(duì)照對(duì)測(cè)定沒有干擾。薄層層析圖譜如圖3所示。

2.1.4 人工牛黃 取本品粉末1.5 g，加甲醇10 mL，超聲處理20 min，搖勻，濾過(guò)，取濾液作為供試品溶液。取豬去氧膽酸對(duì)照品，加甲醇制成濃度為1 mg/mL的溶液，作為對(duì)照品溶液。另取除人工牛黃藥材外其他七味藥材粉末，按處方比例混合均勻，稱取約1.5 g，按供試品溶液制備方法制成陰性對(duì)照溶液。照薄層色譜法(《中國(guó)藥典》2015版通則0502)試驗(yàn)，吸取供試品溶液與陰性對(duì)照溶液各8 μL，豬去氧膽酸對(duì)照品溶液2 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以正己烷-乙酸乙酯-醋酸-甲醇(20∶25∶2∶3)上層溶液為展開劑[9-10]，展開，展距為12 cm，取出薄層板，晾干，噴以10%磷鉬酸乙醇溶液，待乙醇揮干后，置于烘箱中105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。結(jié)果顯示，供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，且陰性對(duì)照對(duì)測(cè)定沒有干擾。薄層層析圖譜如圖4。

2.1.5 胡黃連 取小兒清肺八味丸約10 g，加甲醇10 mL，超聲處理20 min，濾過(guò)，濾液作為供試品溶液。取胡黃連苷Ⅰ對(duì)照品、胡黃連苷Ⅱ?qū)φ掌愤m量，分別加甲醇制成濃度為1 mg/mL的溶液，作為對(duì)照品溶液。另取除胡黃連藥材外其他七味藥材粉末，按處方比例混合均勻，稱取約10 g，按上述供試品溶液制備方法制備陰性對(duì)照溶液。照薄層色譜法(《中國(guó)藥典》2015版通則0502)試驗(yàn)，吸取供試品溶液、胡黃連苷Ⅰ對(duì)照品、胡黃連苷Ⅱ?qū)φ掌?、陰性?duì)照溶液各10 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠GF254薄層板上，以水飽和乙酸乙酯為展開劑[11]，展開，展距為12 cm，取出，晾干，再以氯仿-甲醇-乙酸乙酯-甲酸(7∶3∶5∶0.1)為展開劑，展開，取出，晾干，置254 nm紫外光燈下檢視。結(jié)果供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，且陰性對(duì)照對(duì)測(cè)定沒有干擾。薄層層析圖譜如圖5所示。

2.2 含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件 色譜柱：Agilent Eclipse Plus C18(250 mm×4.6 mm, 5 μm)；流動(dòng)相：甲醇-0.2%磷酸水溶液(31∶69)；流速∶1.0 mL/min；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)：275 nm。

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備 取胡黃連苷I對(duì)照品、胡黃連苷Ⅱ?qū)φ掌愤m量，精密稱定，加30%乙醇，制成濃度分別為38 μg/mL、84 μg/mL的胡黃連苷I和胡黃連苷Ⅱ混合對(duì)照品溶液，即得。

2.2.3 供試品溶液的制備 精密稱定小兒清肺八味丸粉末2 g ，于具塞錐形瓶中，精密加入30%乙醇25 mL ，密塞，稱定重量，超聲處理(功率500 W，頻率40kHz)40 min，放冷，再稱定重量，用30%乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，離心，取續(xù)濾液，過(guò)微孔濾膜(0.45 μm)，即得。

2.2.4 陰性對(duì)照溶液的制備 按處方比例，制備不含胡黃連的陰性樣品，再照“2.2.3”項(xiàng)下操作制備陰性對(duì)照溶液，即得。

2.2.5 專屬性試驗(yàn) 精密吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液及陰性對(duì)照溶液各10 μL，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣并記錄色譜圖。供試品呈現(xiàn)與對(duì)照品保留時(shí)間相同的色譜峰，陰性對(duì)照無(wú)干擾。色譜圖如圖6所示。

2.2.6 線性關(guān)系考察 精密稱取胡黃連苷I對(duì)照品和胡黃連苷Ⅱ?qū)φ掌愤m量，置50 mL量瓶中，加入30%乙醇制成胡黃連苷I和胡黃連苷Ⅱ濃度分別為76 μg/mL和168 μg/mL的混合對(duì)照品儲(chǔ)備液。分別精密吸取上述儲(chǔ)備液0.5、1.5、2.5、5、7.5、10 mL，置10 mL量瓶中，加30%乙醇稀釋至刻度，搖勻。按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定峰面積，以峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，對(duì)照品濃度(X)為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得胡黃連苷I 、胡黃連苷Ⅱ回歸方程分別為Y=262.65X+0.030(r=0.9999)、Y=121.76X+0.025(r=0.9999)。結(jié)果表明，胡黃連苷I(3.8～76 μg/mL)和胡黃連苷Ⅱ(8.4～168 μg/mL)均在對(duì)應(yīng)濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液(批號(hào)1609071)，分別于室溫下0、6、10、18、24 h測(cè)定含量以考察溶液的穩(wěn)定性。結(jié)果顯示，在不同時(shí)間點(diǎn)測(cè)得胡黃連苷I峰面積RSD=0.88%，測(cè)得胡黃連苷Ⅱ峰面積RSD=0.19%。表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.8 精密度試驗(yàn) 取同一供試品溶液(批號(hào)1609071)，連續(xù)進(jìn)樣6次，分別測(cè)得6次進(jìn)樣的峰面積積分值。結(jié)果顯示，胡黃連苷I峰面積RSD=0.60%(n=6)，胡黃連苷Ⅱ峰面積RSD=0.50%(n=6)。表明儀器精密度好。

2.2.9 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一供試品(批號(hào)1609071)6份，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.2.1” 的色譜條件進(jìn)樣并記錄色譜圖。分別計(jì)算胡黃連苷I和胡黃連苷Ⅱ含量。結(jié)果顯示，胡黃連苷I平均含量為0.38mg/g，RSD為1.06%(n=6)；胡黃連苷Ⅱ的平均含量為0.82mg/g，RSD為0.70%(n=6)。表明方法重復(fù)性好。

2.2.10 加樣回收試驗(yàn) 取已知含量供試品(批號(hào)1609071)9份，每份約1g，分別加入一定量的胡黃連苷I和胡黃連苷Ⅱ?qū)φ掌焚A備液，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.2.1” 的色譜條件進(jìn)樣并記錄色譜圖。計(jì)算回收率，結(jié)果見表1。

2.2.11 供試品測(cè)定 取12批供試品各約2 g，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.2.1 色譜條件”進(jìn)樣并記錄色譜圖。計(jì)算胡黃連苷I和胡黃連苷Ⅱ的含量。結(jié)果見表2。

2.2.12 含量限度的制定 采用HPLC法對(duì)12批供試品及3批胡黃連藥材進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果胡黃連苷Ⅰ與胡黃連苷Ⅱ的平均轉(zhuǎn)移率47.51%，由于不同產(chǎn)地胡黃連的胡黃連苷Ⅰ與胡黃連苷Ⅱ含量有所不同，參考《中國(guó)藥典》2015年版一部“胡黃連”項(xiàng)下有關(guān)規(guī)定，確定本品每1 g含胡黃連苷Ⅰ與胡黃連苷Ⅱ的總量不得少于0.078%。今后可進(jìn)一步研究積累相關(guān)數(shù)據(jù)再作調(diào)整。

表1 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果 (n=9)

續(xù)表1

表1 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果 (n=9)

表2 供試品含量測(cè)定結(jié)果

3 討論

3.1 薄層色譜鑒別 在紅花的薄層鑒別中，相比青島海洋化工廠硅膠H板,煙臺(tái)市化學(xué)工業(yè)研究所H板斑點(diǎn)清晰、分離度好、Rf值適中；分析原因可能是不同生產(chǎn)企業(yè)所用的硅膠質(zhì)量有差別。為驗(yàn)證方法的耐用性，增加人工手鋪薄層板對(duì)照試驗(yàn)。結(jié)果顯示，其與煙臺(tái)化學(xué)工業(yè)研究所H板的效果一致。

參照《中國(guó)藥典》2015年版“人工牛黃”鑒別項(xiàng)下以膽酸、豬去氧膽酸對(duì)照品為指標(biāo)建立小兒清肺八味丸中人工牛黃的薄層色譜鑒別方法。結(jié)果在與膽酸對(duì)照品相應(yīng)的位置上，陰性有干擾，在與豬去氧膽酸對(duì)照品相應(yīng)位置上，陰性無(wú)干擾。因此本次試驗(yàn)僅建立以豬去氧膽酸為對(duì)照品的薄層色譜鑒別方法。

經(jīng)查閱文獻(xiàn)，天竺黃的主要化學(xué)成分為硅酸鹽、無(wú)機(jī)元素及氨基酸[12-13]，參照《中國(guó)藥典》2015年版一部“天竺黃”鑒別項(xiàng)下以亮氨酸、丙氨酸為對(duì)照品，對(duì)小兒清肺八味丸進(jìn)行薄層色譜鑒別研究[7]，結(jié)果陰性對(duì)照有干擾，方法專屬性不強(qiáng)，需要進(jìn)一步研究。

此外，上述5個(gè)薄層色譜鑒別方法均對(duì)不同溫度(3.5℃、4.1℃、 2.2℃、4.5℃、3.5℃)、濕度(68%、70%、66%、74%、72%)條件進(jìn)行了驗(yàn)證，結(jié)果顯示建立的薄層色譜鑒別方法耐用性良好。

3.2 色譜條件選擇 參照《中國(guó)藥典》2015年版一部“胡黃連”項(xiàng)下的含量測(cè)定方法[7]，以甲醇-水-磷酸溶液(35∶65∶0.1)為流動(dòng)相進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果顯示，色譜峰分離度較差且胡黃連苷Ⅰ色譜峰有拖尾現(xiàn)象。經(jīng)試驗(yàn)摸索將流動(dòng)相調(diào)整為甲醇-0.2%磷酸溶液(31∶69)時(shí)，色譜峰分離度達(dá)到要求、拖尾現(xiàn)象改善、出峰時(shí)間適中、峰型較好[14]。

3.3 提取條件選擇 胡黃連中胡黃連苷I和胡黃連苷Ⅱ是環(huán)烯醚萜類化合物，易溶于水和甲醇，可溶于乙醇、丙酮和正丁醇等[15]。因此試驗(yàn)分別比較了水、甲醇、30%乙醇、70%乙醇、乙醇的提取效果。結(jié)果表明，30%乙醇提取效果最佳，峰型最好；試驗(yàn)對(duì)回流提取和超聲提取進(jìn)行了比較[16]。結(jié)果表明，回流提取與超聲提取效率相似。考慮到方法的簡(jiǎn)便易行，確定采用超聲提取方法；試驗(yàn)對(duì)提取時(shí)間進(jìn)行了考察。結(jié)果表明，超聲提取40 min供試品中胡黃連苷Ⅰ和胡黃連苷Ⅱ的含量基本穩(wěn)定不變，故將超聲提取時(shí)間定為40 min。

該實(shí)驗(yàn)為小兒清肺八味丸提供了科學(xué)、可靠的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，確保了用藥的安全、有效。