羅小端，鐘繼濤，宋 澤，聶華明，王泉雄

(云夢(mèng)縣中醫(yī)院，湖北 云夢(mèng) 432500)

骨肉瘤(osteosarcoma，OS)占兒童惡性腫瘤的6%，年發(fā)病率約為3/100萬(wàn)[1]，有惡性程度高、較早發(fā)生侵襲和血性轉(zhuǎn)移、預(yù)后差等特點(diǎn)[2]。骨肉瘤的發(fā)生與遺傳、環(huán)境等多種因素有關(guān)，近年來(lái)研究表明[3]，非編碼小分子miRNA 在骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展中起著關(guān)鍵作用。miRNA調(diào)控約1/3的蛋白編碼基因，并且參與了包括細(xì)胞增殖、分化、細(xì)胞周期和凋亡等在內(nèi)的諸多生理生化過(guò)程。MiR-19a作為一種新型腫瘤標(biāo)志物具有非常重要意義，其生物學(xué)特征有助于骨肉瘤的診斷和預(yù)后，也為藥物的靶向研究提供理論依據(jù)和新的治療前景。因此，我們主要研究miR-19a在骨肉瘤中的表達(dá)情況，探討其在骨肉瘤患者診斷及預(yù)后中的臨床價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取武漢大學(xué)中南醫(yī)院2012～2017年骨科收治的骨肉瘤患者病理切片中90例凍存骨肉瘤組織及其對(duì)應(yīng)的癌旁非腫瘤組織標(biāo)本，本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者簽署知情同意書(shū)。其中男45例，女45例；年齡7～65歲，年齡<22歲患者47例，年齡≥22歲患者43例。隨訪(fǎng)1～36個(gè)月，其中隨訪(fǎng)期間總死亡17例。Enneking外科診斷分期[4]:Ⅰ期及Ⅱa期病例53例，Ⅱb期及Ⅲ期病例37例。

1.2 方法

將組織標(biāo)本使用TRIzol及氯仿提取RNA。取1μg總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以cDNA為模板，用Real-Time PCR內(nèi)參基因GAPDH引物做Q-PCR擴(kuò)增，檢測(cè)基因miR-19a的表達(dá)水平。Real-Time PCR反應(yīng)體系：SYBR?Premix Ex TaqTM Ⅱ(2×)25μL，PCR Forward Primer(10μM)2μL，PCR Reverse Primer(10μM)2μL，ROX Reference Dye(50×)1μL，DNA模板4μL，ddH20(滅菌蒸餾水)16μL；反應(yīng)條件：95°C、30s一個(gè)循環(huán)，然后95°C、5s，60°C、30s進(jìn)行四十個(gè)循環(huán)。

每一個(gè)基因的表達(dá)水平以其相對(duì)內(nèi)參GAPDH的水平形式呈現(xiàn)。使用的PCR引物如下:MiR-19a上游，5'-GCGTGTGCAAATCTATGCAA-3';下游，5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3';U6上游，5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，下游5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。用GraphPad Prism 6軟件進(jìn)行定量和分析，最后結(jié)果以2-△△Ct分析。

1.3 觀(guān)察指標(biāo)

(1)比較骨肉瘤患者骨肉瘤組織樣本及癌旁非腫瘤組織中miR-92a表達(dá)水平。

(2)miR-19a對(duì)骨肉瘤患者預(yù)后的影響：將90例骨肉瘤患者以miR-19a表達(dá)的中位值為分界線(xiàn)，分為高表達(dá)組(n=45)和低表達(dá)組(n=45)，其表達(dá)與患者性別、年齡、腫瘤部位沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，兩組患者具有可比性。所有患者均獲得隨訪(fǎng)，隨訪(fǎng)時(shí)間1～36個(gè)月，末次隨訪(fǎng)時(shí)間為2017年12月。

(3)骨肉癌組織中miR-19a表達(dá)與臨床分期及臨床指標(biāo)：miR-19a表達(dá)與腫瘤的TNM分期、腫瘤的體積、有無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移之間的關(guān)系。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)均應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 22進(jìn)行分析，計(jì)量資料采用非配對(duì)t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料行卡方檢驗(yàn)。當(dāng)P<0.05時(shí)，表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 miR-19a在骨肉瘤組織樣本及癌旁非腫瘤組織中的表達(dá)情況

miR-19a在骨肉瘤組織中的表達(dá)量為(2.439±0.162)，在瘤旁組織中的表達(dá)量為(1.547±0.144)，骨肉瘤組織中的表達(dá)水平明顯高于對(duì)應(yīng)癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，見(jiàn)圖1。

圖1 Q-PCR檢測(cè)miR-19a在骨肉瘤組織及其癌旁組織中的表達(dá)比較，***P<0.001(n=90)

2.2 miR-19a對(duì)骨肉瘤患者預(yù)后的影響

隨訪(fǎng)結(jié)果，因復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移死亡患者總共有16例(MiR-19a低表達(dá)組5例，高表達(dá)組11例)，MiR-19a高表達(dá)組患者3年生存率明顯低于低表達(dá)組(P<0.05)，見(jiàn)圖2(封三)。

2.3 骨肉癌組織中miR-19a表達(dá)與臨床分期及臨床指標(biāo)的關(guān)系

在骨肉瘤患者中，miR-19a的低表達(dá)和高表達(dá)比較，腫瘤體積、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和TNM分級(jí)有差異(P=0.001)，見(jiàn)表1。

表1 骨肉瘤組織miR-19a水平與患者臨床病理參數(shù)之間的相關(guān)性

3 討 論

骨肉瘤多起源于長(zhǎng)骨干骺端，隨著診療水平的提高，手術(shù)及新輔助化療等綜合治療的應(yīng)用，5年生存率提高至60%～70%[5]。骨肉瘤早期癥狀缺乏特異性，大多數(shù)患者到晚期才被確診。因此，尋找高靈敏度、高特異度的生物標(biāo)志物在骨肉瘤的篩查和早期診斷中越來(lái)越重要[6]。研究表明[7]miRNA在骨肉瘤的篩查、診斷和預(yù)后判斷中具有重要意義，miR-17-92與人類(lèi)癌癥的發(fā)病密切相關(guān)，在多種惡性腫瘤中表達(dá)上調(diào)，包括結(jié)腸癌、B細(xì)胞淋巴瘤、胃癌和小細(xì)胞肺癌。miR-17-92基因簇定位于13q31.3(即13號(hào)染色體25號(hào)開(kāi)放閱讀框的3號(hào)內(nèi)含子區(qū)域)，該基因編碼產(chǎn)生6個(gè)成熟的miRNA：miR-17、miR-18a、miR-19a、miR-20a、miR-19b和miR-92a[8]。

miR-19a作為miR-17-92基因簇基因的重要成員[9]，促進(jìn)其表達(dá)可提高抑癌基因(PTEN)的活性及有效含量，提高PTEN基因啟動(dòng)子的表達(dá)水平，形成一個(gè)開(kāi)放的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)，促進(jìn)與轉(zhuǎn)錄因子Egr-1的結(jié)合，進(jìn)而誘導(dǎo)基因的表達(dá)[10-11]；同時(shí)可增強(qiáng)PTEN蛋白與目標(biāo)蛋白PDZ結(jié)合序列的相互作用，抑制PTEN/PI3K/Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，阻止腫瘤生長(zhǎng)[12-14]。

本研究發(fā)現(xiàn)，miR-19a在癌組織的表達(dá)明顯高于其對(duì)應(yīng)的癌旁組織(P<0.05)；且高表達(dá)與腫瘤的病理分期密切相關(guān)；遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移率也明顯高于低表達(dá)組(P<0.05)；預(yù)后分析表明miR-19a的表達(dá)情況與骨肉瘤患者預(yù)后密切相關(guān)。說(shuō)明miR-19a通過(guò)參與細(xì)胞信號(hào)通路的調(diào)節(jié)而影響腫瘤增殖與遷移的生物學(xué)特性，具有作為骨肉瘤生物標(biāo)志物的潛力。

綜上所述，作為骨肉瘤預(yù)后生物標(biāo)志物，miR-19a具有重要的應(yīng)用前景和臨床應(yīng)用價(jià)值。