周 躍，李青春，周燕紅**

(1.咸寧愛爾眼科醫(yī)院/湖北科技學(xué)院附屬眼科醫(yī)院，湖北 咸寧 437100;2.湖北科技學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院)

我國已成為全球糖尿病(diabetes mellitus，DM)第一大國。DM導(dǎo)致眼部視網(wǎng)膜微血管損傷稱為糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy，DR)，DR是DM最常見最嚴(yán)重的并發(fā)癥之一。DR已經(jīng)對公共健康構(gòu)成重大威脅，但其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，尚未完全清楚。人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞(retinal pigment epithelium，RPE)是DR體外研究最常用的細(xì)胞之一。RPE位于脈絡(luò)膜和視網(wǎng)膜神經(jīng)上皮層之間，當(dāng)長期處于慢性高血糖環(huán)境時受到損傷，視網(wǎng)膜的外屏障功能受到破壞發(fā)生DR[1]。我們國家在使用天然藥物植物、中草藥防治疾病方面已有豐富的經(jīng)驗(yàn)，近年來，國內(nèi)外學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)中藥防治DR有一定的效果。白藜蘆醇(resveratrol，Res)廣泛存在于藜蘆、葡萄和漿果類等植物果實(shí)中，具有多種藥理活性。Res是一種天然的抗氧化劑，能清除體內(nèi)自由基，具有抗炎、抗氧化等多種生物學(xué)活性作用。本研究探討Res聯(lián)合5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil，5-Fu)對人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞ARPE-19氧化損傷的影響及其可能的機(jī)制，為DR的臨床防治提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)及尋找新的方法。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑

人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞株ARPE-19由中山眼科中心惠贈；Res購自于sigma公司；5-Fu購自于武漢艾斯萊德生物科技有限公司；CCK8(cell counting kit-8)試劑盒購自于上海碧云天生物技術(shù)公司；丙二醛(malondialdehyde，MDA)、超氧化物歧化酶(superoxyde dismutase，SOD)、谷胱甘肽過氧化酶(GSH-Px)試劑盒購自于南京建成生物工程研究所(Glu，D-葡萄糖粉，sigma公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和分組

ARPE-19細(xì)胞株復(fù)蘇于超凈臺內(nèi)，加入盛有10%胎牛血清的DMEM/F12細(xì)胞培養(yǎng)液中，置于37℃，5%CO2條件培養(yǎng)箱中孵育。

ARPE-19細(xì)胞分為五組如下：正常對照組(5.5mmol/L Glu)，高糖組(30mmol/L Glu)，Res組(30mmol/L Glu+10μmol/L Res)，Res+5-Fu組(30mmol/L Glu+10μmol/L Res+0.6μg/mL 5-Fu)，5-Fu組(30mmol/L Glu+0.6μg/mL 5-Fu)。5-Fu組濃度選擇見參考文獻(xiàn)[2]。

1.3 CCK-8 法檢測Res對ARPE-19細(xì)胞增殖的影響

消化長至80%～90%融合時的細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度到3×104/mL，接入96孔板，每孔200μL細(xì)胞懸液，37℃培養(yǎng)過夜(在細(xì)胞孔周圍孔內(nèi)加入100μL無菌PBS封閉)。分別處理細(xì)胞，每組6個復(fù)孔，37℃培養(yǎng)。

1.3.1 確定ARPE-19細(xì)胞最佳的作用時間

每孔分別加入含30mmol/L葡萄糖(高糖組)；含5.5mmol/L葡萄糖和24.5mmol/L甘露醇(高滲對照組)；葡萄糖濃度為5.5mmol/L(正常對照組)。分別培養(yǎng)24h、48h和72h。

1.3.2 確定Res對ARPE-19細(xì)胞最佳的作用濃度

每孔分別加入30mmol/L葡萄糖(高糖組)；30mmol/L葡萄糖加5μmol/L Res；含30mmol/L葡萄糖加10μmol/L Res；30mmol/L葡萄糖加25μmol/L Res；30mmol/L葡萄糖加50μmol/L Res。分別培養(yǎng)已確定好的最佳作用時間。

每孔加入20μL CCK-8試劑，置于37℃培養(yǎng)箱中4h。酶標(biāo)儀450nm測定各孔吸光值OD 450。

1.4 CCK-8法檢測Res+5-Fu對ARPE-19細(xì)胞增殖的影響

CCK-8法檢測方法同1.3。

藥物處理如下：每孔分別加入5.5mmol/L葡萄糖，30mmol/L葡萄糖，30mmol/L葡萄糖加10μmol/L Res，30mmol/L葡萄糖加10μmol/L Res加5-Fu 0.6μg/mL，30mmol/L葡萄糖加5-Fu 0.6μg/mL，培養(yǎng)48h。

1.5 SOD、MDA、GSH-Px的測定

參照SOD、MDA、GSH-Px試劑盒說明書，分別測定SOD活性、MDA含量及GSH-Px活力。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測Res對ARPE-19細(xì)胞增殖的影響

2.1.1 確定ARPE-19 細(xì)胞的最佳作用時間

處理24h時后，正常對照組、高糖組和高滲對照組三組間細(xì)胞活性無差異(P>0.05)。處理48h時后，與正常對照組相比，高糖組RPE細(xì)胞活性顯著降低(P<0.05)，高滲對照組無差異(P>0.05)；處理72h時后，與正常對照組相比，高糖組RPE細(xì)胞活性顯著降低(P<0.05)，高滲對照組無差異(P>0.05)。處理72h與48h時相比，高糖組RPE細(xì)胞活性無差異(P>0.05)。因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)確定48h為最佳的作用時間。見表1。

表1 ARPE-19細(xì)胞活力

與正常對照組比較，*P<0.01；與48h高糖組比較，#P<0.01

2.1.2 確定Res對ARPE-19細(xì)胞的最佳作用濃度

0、5、10、25、50μmol/L的Res分別作用于ARPE-19細(xì)胞48h后，藥物濃度由低到高，各組細(xì)胞的活性均受到不同程度的影響。5、10、25、50μmol/L的Res組細(xì)胞活性高于高糖(P<0.05)。當(dāng)Res濃度為10μmol/L時ARPE-19細(xì)胞活力最強(qiáng)。因此，本研究的后續(xù)實(shí)驗(yàn)取Res濃度為10μmol/L為最佳的作用濃度。見表2。

表2 Res干預(yù)ARPE-19細(xì)胞活力

與高糖組比較，*P<0.05，**P<0.01

2.2 CCK-8檢測Res+5-Fu對ARPE-19細(xì)胞增殖的影響

Res組細(xì)胞活性高于高糖組(P<0.05)。5-Fu細(xì)胞活性高于高糖組(P<0.05)。Res+5-Fu聯(lián)合應(yīng)用細(xì)胞活性明顯高于高糖組(P<0.05)。Res+5-Fu聯(lián)合應(yīng)用細(xì)胞活性高于Res組(P<0.05)。見表3。

表3 Res+5-Fu干預(yù)ARPE-19細(xì)胞活力

與正常對照組比較，*P<0.01；與高糖組比較，#P<0.01；與Res組比較，ΔP<0.01

2.3 ARPE-19細(xì)胞SOD、MDA、GSH-Px表達(dá)

與正常對照組相比，高糖組SOD和GSH-Px減少、MDA增高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與高糖組相比，Res組SOD、GSH-Px增高、MDA降低，，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與Res相比，Res+5-Fu組SOD和GSH-Px升高、MDA減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表4，圖1～3(封二)。

表4 ARPE-19細(xì)胞SOD、MDA、GSH-Px表達(dá)

與正常對照組比較，*P<0.05，**P<0.01；與高糖組比較，#P<0.01；與Res組比較，ΔP<0.05，ΔΔP<0.01

3 討 論

隨著經(jīng)濟(jì)發(fā)展和生活水平的提高，DM發(fā)病率在全世界呈指數(shù)上升，使得DR成為全球失明的最主要原因之一。長期高血糖狀態(tài)是DR最主要的危險因素，高血糖啟動炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激，導(dǎo)致視網(wǎng)膜神經(jīng)-血管的損傷[3-4]。RPE參與視網(wǎng)膜的營養(yǎng)和代謝，能夠清除視網(wǎng)膜自由基。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)Res能改善DM大鼠視網(wǎng)膜病理變化，延緩DM視網(wǎng)膜病變發(fā)生和發(fā)展[5]。在此基礎(chǔ)上，我們采用人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞株ARPE-19為研究對象，CCK-8法檢測Res對ARPE-19細(xì)胞增殖的影響，確定Res對ARPE-19細(xì)胞最佳作用時間(48h)和最佳作用濃度(10μmol/L)。有研究發(fā)現(xiàn)[2]5-Fu能抑制RPE細(xì)胞增殖，可用于增殖性玻璃體視網(wǎng)膜病變(PVR)的防治。但Res+5-Fu聯(lián)用對ARPE-19細(xì)胞增殖的影響尚未見報道，故本研究使用CCK-8法檢測Res+5-Fu聯(lián)用對ARPE-19細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果顯示Res對細(xì)胞增殖有明顯抑制作用，Res+5-Fu聯(lián)用對細(xì)胞增殖的抑制作用更加明顯。

高糖產(chǎn)生活性氧(reactive oxygen species，ROS)，引起氧化應(yīng)激，是DR發(fā)生發(fā)展的重要危險因子。DR視網(wǎng)膜內(nèi)自由基增加，對氧化應(yīng)激環(huán)境中的內(nèi)皮細(xì)胞有保護(hù)作用的SOD減少，而在DM慢性并發(fā)癥中起著重要作用的MDA增高[6-7]。SOD和GSH-Px能有效降解和清除ROS。研究證實(shí)Res對過氧化氫誘導(dǎo)的人RPE細(xì)胞氧化損傷有保護(hù)作用[8]。SOD將陰離子歧化為H2O2，H2O2被GSH分解為H2O和O2，起到清除ROS，抑制機(jī)體氧化應(yīng)激作用，可以減緩DR的發(fā)生發(fā)展。有研究表明Res通過抑制氧化應(yīng)激，抑制內(nèi)毒素誘導(dǎo)的葡萄膜炎以阻止眼內(nèi)炎的發(fā)生[9]。MDA間接反應(yīng)機(jī)體受自由基攻擊的程度，是評估機(jī)體氧化應(yīng)激損傷的重要指標(biāo)。

本研究檢測ARPE-19細(xì)胞SOD、MDA、GSH-Px表達(dá)，觀察Res+5-Fu對ARPE-19細(xì)胞氧化損傷的作用。結(jié)果表明：Res能顯著增加ARPE-19細(xì)胞SOD、GSH-Px的活性，降低MDA活性，表明Res對ARPE-19細(xì)胞具有清除自由基及抗氧化作用；Res+5-Fu使SOD和GSH-Px升高更明顯、MDA減少更低，表明Res+5-Fu具有強(qiáng)大的抗氧化能力，能通過抑制脂質(zhì)過氧化，減輕DR的氧化損傷。

綜上所述，Res聯(lián)合5-Fu對人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞增殖有明顯的抑制作用，其作用機(jī)制可能與調(diào)節(jié)SOD、GSH-Px、MDA等抗氧化因子的活性，增強(qiáng)機(jī)體抗氧化能力，保護(hù)RPE細(xì)胞有關(guān)。本研究可為進(jìn)一步研究Res聯(lián)合5-Fu治療DR的機(jī)制，研發(fā)防治DR藥物提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。