季福慶，李夢婓，印玉龍，呂勇剛

西北大學(xué)附屬醫(yī)院/西安市第三醫(yī)院甲乳外科，陜西 西安 710018

乳腺癌在臨床上具有較高的發(fā)病率，其屬于導(dǎo)致女性腫瘤患者發(fā)生死亡的主要原因[1]。同時有資料顯示，乳腺癌患者的發(fā)病年齡呈現(xiàn)出年輕化的趨勢，已經(jīng)成為急需解決的公共衛(wèi)生問題[2]。目前臨床上對乳腺癌患者開展治療的方法包括手術(shù)治療、放射治療、化療以及內(nèi)分泌治療等，若患者存在放療適應(yīng)證，則在為其開展手術(shù)治療后，實施放射治療進行輔助，可有效降低患者的疾病復(fù)發(fā)率[3]。有資料報道稱，在乳腺癌疾病轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的過程中，循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulating tumor cells，CTCs)和循環(huán)腫瘤細(xì)胞DNA(circulating tumor cell DNA，ctDNA)均發(fā)揮著重要作用[4]。因此通過檢測CTCs與ctDNA水平，可為乳腺癌的診斷及預(yù)后評估起到積極作用[5]。本研究旨在探討乳腺癌患者CTCs、ctDNA的檢測水平及其診斷價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2017 年1 月至2019 年1 月西北大學(xué)附屬醫(yī)院收治的乳腺癌患者60 例作為觀察組，選取同期在我院接受體檢的女性健康者50例作為對照組。觀察組患者年齡22～75歲，平均(51.8±6.1)歲；病理分期中，Ⅰ期5 例，Ⅱ期30 例，Ⅲ期25 例；絕經(jīng)前35 例，絕經(jīng)后25 例。對照組健康者年齡21～77 歲，平均(51.8±6.5)歲；絕經(jīng)前30例，絕經(jīng)后20例。兩組受檢者的年齡和絕經(jīng)情況比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，受檢者均知情并簽署同意書。

1.2 病例選擇 納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)乳腺癌經(jīng)術(shù)后病理檢查或穿刺活檢確診；(2)具備完整臨床資料及影像學(xué)資料；(3)乳腺癌患者病灶未出現(xiàn)轉(zhuǎn)移。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)機體存在其他惡性腫瘤疾病者；(2)凝血功能異常者；(3)肝腎功能嚴(yán)重障礙者；(4)先天性心臟疾病患者；(5)入組前近期行內(nèi)分泌外相關(guān)治療的患者。

1.3 觀察指標(biāo) 比較不同特征患者及對照組受檢者的CTCs陽性率與ctDNA水平，包括TNM分期為Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期，M 分期為M0 期與M1 期，浸潤型導(dǎo)管癌與浸潤型小葉癌，＞50歲與≤50歲患者。

1.4 檢測方法 采集所有受檢者肘靜脈血7.5 mL，應(yīng)用肝素實施抗凝處理，在冷卻10 min后采用5 mL磷酸緩沖鹽溶液稀釋，加入淋巴細(xì)胞分離液3 mL，離心取血清，加入磷酸緩沖鹽溶液2 mL，混合均勻后離心，去除上清液，加入波形蛋白抗體、細(xì)胞角蛋白抗體、CD45各0.5 μL 后混勻，靜置30 min，離心后實施檢測。采用流失細(xì)胞分析術(shù)開展分析，依靠側(cè)向反散射對前向散射做二維散射點，然后設(shè)立R1門，同時應(yīng)用CD45-細(xì)胞，根據(jù)側(cè)向反散射對細(xì)胞角蛋白進行二維散射點制作，并應(yīng)用細(xì)胞角蛋白（+）細(xì)胞設(shè)置R2門。應(yīng)用R2門細(xì)胞通過波形蛋白對上皮細(xì)胞黏附分子進行二維散射點制作，采用上皮細(xì)胞黏附分子(+)和波形蛋白(+)進行R3 門制作，從而獲取散點圖，對數(shù)據(jù)開展分析。若檢查結(jié)果顯示波形蛋白(+)、CD45(-)、上皮細(xì)胞黏附分子(+)以及細(xì)胞角蛋白(+)，則可判定為陽性，若CTCs 水平在5/7.5 mL 及以上，則可判定為轉(zhuǎn)移陽性。采集晨起空腹靜脈血5 mL，放入含有乙二胺四乙酸(EDTA)的抗凝管內(nèi)，離心機中以1 600 r/min速度離心10 min，采集上層血漿，將其裝入離心管內(nèi)，離心管容量為2 mL，將下層血細(xì)胞放入到凍存管內(nèi)，則得到檢測所需要的血細(xì)胞。血漿放入離心機中實施離心處理，殘余細(xì)胞去除后，將上清液轉(zhuǎn)入到離心管內(nèi)，則得到所需要的血漿，保存于冰箱內(nèi)待檢。應(yīng)用QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit 操作流程開展血漿游離DNA提取，實施傳統(tǒng)DNA測序。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用t檢驗，計數(shù)資料比較采用χ2檢驗，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組受檢者的CTCs陽性率比較 觀察組患者 的CTCs 陽性率為38.33% (23/60)，ctDNA 水平為(152.6±12.4)ng/mL；對照組CTCs均為陰性，ctDNA水平為(28.1±4.3) ng/mL，觀察組CTCs 陽性率與ctDNA水平明顯高于對照組，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(t=67.644，P=0.001)。

2.2 觀察組不同特征患者的CTCs 陽性率和ctDNA 水平比較 不同年齡與病理類型乳腺癌患者的CTCs陽性率與ctDNA水平比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)；不同乳腺癌TNM 分期患者CTCs 陽性率與ctDNA水平比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，見表1。

表1 觀察組不同特征患者的CTCs陽性率和ctDNA水平比較

3 討論

乳腺癌是女性高發(fā)惡性腫瘤，主要特征為乳頭回縮、乳房皮膚橘皮樣改變和乳頭溢液等[6]。以往臨床上主要采用乳房切除聯(lián)合腋窩淋巴結(jié)清掃術(shù)對患者進行治療，對機體創(chuàng)傷大，手術(shù)時間長，容易產(chǎn)生多種并發(fā)癥，且術(shù)后乳房美觀度差，影響患者的身心健康[7]。近年來，保留乳房手術(shù)逐漸受到患者的青睞，同時可達(dá)到和傳統(tǒng)手術(shù)相似的治療效果，可明顯提高患者術(shù)后生活質(zhì)量[8]。

在乳腺癌的診斷方面，臨床上主要通過傳統(tǒng)影像學(xué)檢查和組織學(xué)檢查。但是，臨床研究顯示傳統(tǒng)的診斷措施對患者的診斷敏感性不高。近年來隨著液體活檢技術(shù)的不斷發(fā)展，CTCs 檢測和ctDNA 檢測在臨床上的應(yīng)用率不斷提升。ctDNA 屬于新型腫瘤標(biāo)志物，通過對外周血中傳統(tǒng)DNA 總量進行測量，或檢測特定基因發(fā)生，可能會為腫瘤疾病的療效評價及預(yù)后評估提供參考[9-10]。有研究人員通過選取乳腺癌患者，分別為其開展糖類抗原153、CTCs、影像學(xué)檢查與ctDNA檢測，評估4種檢測方法所具備的敏感度，結(jié)果顯示ctDNA 可對疾病狀況進行更為高效的反映[11]。同時也有資料報道稱，通過對轉(zhuǎn)移性乳腺癌與卵巢癌患者的血ctDNA 水平實施檢測，可使疾病的臨床進程得到有效反映[12]。當(dāng)機體處于健康狀態(tài)時，外周血內(nèi)的ctDNA 水平較低，通常為3～63 ng/mL，而當(dāng)機體出現(xiàn)腫瘤時，由于循環(huán)癌細(xì)胞發(fā)生壞死和凋亡，將會導(dǎo)致血液內(nèi)的DNA 水平明顯升高，從而使ctDNA 水平明顯高于健康人群，其濃度通?？蛇_(dá)到122～462 ng/mL[13]。

相較于傳統(tǒng)影像學(xué)檢查和組織學(xué)檢查，CTCs 檢測和ctDNA 檢測的敏感性更高，可重復(fù)性好。在對CTCs實施檢測時，需做好細(xì)胞檢測與富集工作，可應(yīng)用的檢測方法種類多，包括細(xì)胞檢測、流式細(xì)胞檢測、核酸檢測與免疫細(xì)胞化學(xué)檢測，富集方法包括黏附分離法、密度梯度離心法與免疫磁珠分離法。本研究結(jié)果顯示，對照組CTCs 均為陰性，ctDNA 水平為(28.1±4.3)ng/mL，觀察組CTCs陽性率與ctDNA水平明顯高于對照組。有資料報道稱，對于早期乳腺癌患者而言，其能夠從輔助治療中受益的比例達(dá)到接近30%，而對于晚期轉(zhuǎn)移乳腺癌患者而言，也可在其機體外周血內(nèi)檢測到CTCs，因此通過對患者的CTCs 進行檢測，可為患者的疾病分期提供參考。本次研究結(jié)果顯示，M1期乳腺癌患者的CTCs陽性率明顯高于M0期乳腺癌患者，同時CTCs陽性率在不同TNM分期乳腺癌患者中也具有明顯差異化。

本研究結(jié)果顯示，不同年齡與病理類型乳腺癌患者的CTCs 陽性率與ctDNA 水平無明顯差異；不同乳腺癌TNM 分期患者CTCs 陽性率與ctDNA 水平具有明顯差異。提示隨著乳腺癌分期的改變，患者機體內(nèi)的CTCs 陽性率與ctDNA 水平會出現(xiàn)明顯變化，因此通過對CTCs 陽性率與ctDNA 水平進行檢測，可為患者的疾病分期提供一定參考，從而可使患者的疾病治療更具有針對性。同時有資料報道稱，在腫瘤療效評估中CTCs 也可發(fā)揮一定價值，相較于ctDNA，CTCs檢測可對完整的腫瘤細(xì)胞進行提供，可采用多種RNA、DNA 與蛋白質(zhì)組學(xué)測量方法，對癌癥過程進行全面了解[14-15]。但CTCs 的應(yīng)用過程中存在稀釋以及分離困難等情況，因此當(dāng)患者的疾病處于早期階段時，難以在血漿中發(fā)現(xiàn)CTCs，當(dāng)患者的疾病發(fā)生轉(zhuǎn)移后，血漿中的CTCs 數(shù)量才會明顯增加，從而也使得CTCs 的檢測應(yīng)用受到一定限制[16]。同時有資料報道稱，CTCs與匹配腫瘤細(xì)胞間具有一定差異，因此也可能對其分子生物學(xué)特征的可靠性產(chǎn)生一定影響[17]。因此在檢測過程中，將CTCs與ctDNA進行聯(lián)合應(yīng)用，可有效提升診斷的準(zhǔn)確性和可靠性[18]。

綜上所述，CTC與ctDNA檢測可為乳腺癌的診斷提供有效參考，可作為乳腺癌臨床診斷的有效指標(biāo)。