唐微，譚凌峰，以敏

廣西醫(yī)科大學(xué)第四附屬醫(yī)院柳州市工人醫(yī)院病理科，廣西 柳州 545005

肺癌在當(dāng)今世界最常見的惡性腫瘤中高居首位，近幾十年來，隨著全球生態(tài)環(huán)境的惡化，肺癌的發(fā)病率逐年遞增，特別是肺腺癌，發(fā)病率的上升趨勢(shì)更明顯[1-2]，嚴(yán)重威脅著全球人類的健康與生命。肺腺癌早期沒有明顯的臨床癥狀，發(fā)生發(fā)展難以預(yù)測(cè)，早期肺腺癌多數(shù)在體檢時(shí)發(fā)現(xiàn)，出現(xiàn)癥狀的肺癌患者大部分已經(jīng)是晚期，預(yù)后較差，死亡率高[3-4]。國內(nèi)外學(xué)者研究了多種與肺癌相關(guān)的細(xì)胞因子，但有些結(jié)果卻不太一致，出現(xiàn)這種結(jié)果的原因主要是因?yàn)闃颖緮?shù)量、研究方法的不同以及腫瘤自身所具有的異質(zhì)性造成的。表皮樣生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)是HER/erB 蛋白家族成員之一，編碼跨膜酪氨酸激酶，參與細(xì)胞的生長與分化等過程[5]。有研究顯示胃癌及乳腺癌中EGFR過度表達(dá)預(yù)示其生存期短、預(yù)后較差，且EGFR突變與非小細(xì)胞肺癌發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，是其主要的致癌基因驅(qū)動(dòng)因子[6]。因此，檢測(cè)肺腺癌組織中EGFR的表達(dá)并分析其與肺腺癌臨床病理特征之間的關(guān)系有助于了解其在肺癌發(fā)生發(fā)展中的可能作用機(jī)制。間變性淋巴瘤激酶(anaplastic lymphoma kinase,ALK)是受體酪氨酸激酶胰島素受體超家族的成員之一，位于染色體2P23，其發(fā)病機(jī)制通常源于染色體的重排。研究發(fā)現(xiàn)，部分肺癌患者發(fā)生染色體2P倒位，使ALK基因和棘皮動(dòng)物微管相關(guān)蛋白樣基因EML4發(fā)生融合，從而導(dǎo)致肺癌的發(fā)生發(fā)展[7-8]。因此研究并鑒定肺腺癌進(jìn)程中的關(guān)鍵蛋白ALK的表達(dá)對(duì)肺癌的預(yù)后發(fā)展及評(píng)估十分重要。p53蛋白原是腫瘤抑制基因p53的表達(dá)產(chǎn)物，p53基因的突變或缺失被認(rèn)為是導(dǎo)致多種腫瘤發(fā)生的原因[9]。很多研究發(fā)現(xiàn)p53突變與卵巢漿液性腫瘤、乳腺腫瘤、胃腸道腫瘤及呼吸道腫瘤等多種腫瘤的發(fā)生、進(jìn)展、轉(zhuǎn)移以及治療的耐藥性相關(guān)，被認(rèn)為是預(yù)后不良的因素[10]。因此研究肺腺癌發(fā)展進(jìn)程中p53蛋白的變化十分直觀且重要。本實(shí)驗(yàn)通過研究肺腺癌和肺炎組織中EGFR、ALK 和p53 的表達(dá)差異，EGFR、ALK 和p53 與肺腺癌臨床病理特征的關(guān)系及其三者之間的相關(guān)性，探討他們?cè)诜蜗侔┑陌l(fā)生發(fā)展及預(yù)后評(píng)估中的意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取柳州市工人醫(yī)院病理科2015 年5 月至2017 年8 月的肺腺癌標(biāo)本106 例(肺腺癌組)，肺炎性病變標(biāo)本63 例(肺炎組)，所有標(biāo)本均經(jīng)病理確診，均為病理科包埋好的組織石蠟塊。肺腺癌組標(biāo)本中，男性58 例，女性48 例；年齡30～76 歲，其中≥60 歲51 例，＜60 歲55 例；高分化腺癌33 例，中低分化腺癌73 例；無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移60 例，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移46例；臨床分期為Ⅰ+Ⅱ期者43例，Ⅲ+Ⅳ期者63例。

1.2 試劑及方法 采用SP法進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，操作過程包括切片、烤片脫蠟、脫水、滅活內(nèi)源性過氧化物酶、抗原修復(fù)、抗體孵化、DAB 顯色、復(fù)染、封片等，以PBS 液代替一抗作陰性對(duì)照。EGFR 抗體、p53抗體及SP試劑盒均購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。ALK抗體檢測(cè)試劑盒購自羅氏公司，采用增強(qiáng)DAB檢測(cè)試劑盒和增強(qiáng)擴(kuò)增試劑盒染色。

1.3 結(jié)果判讀 在光學(xué)顯微鏡下對(duì)EGFR、ALK和p53蛋白的表達(dá)情況進(jìn)行判讀，EGFR蛋白表達(dá)判讀標(biāo)準(zhǔn)如下：根據(jù)腫瘤細(xì)胞染色的強(qiáng)弱程度評(píng)分，不著色計(jì)0分，淺黃色計(jì)1分，棕黃色計(jì)2分，棕褐色計(jì)3分；根據(jù)腫瘤細(xì)胞陽性百分比計(jì)分，腫瘤細(xì)胞陽性率＜10%計(jì)0分，10%～40%計(jì)1分，41%～70%計(jì)2分，＞70%計(jì)3分，按著色強(qiáng)度和腫瘤細(xì)胞陽性百分比兩項(xiàng)得分相乘劃分為兩組：陰性為0～4分，陽性表達(dá)為6～9分。ALK抗體的表達(dá)根據(jù)著色的強(qiáng)弱程度判讀：腫瘤細(xì)胞存在很強(qiáng)的顆粒狀胞漿染色(任何百分比的陽性腫瘤細(xì)胞)為陽性，腫瘤細(xì)胞內(nèi)不存在強(qiáng)顆粒狀胞漿染色為陰性。p53抗體的表達(dá)根據(jù)著色的強(qiáng)弱程度及百分比判讀：淡黃色或棕黃色強(qiáng)弱不等著色且陽性細(xì)胞率＜60%為陰性，棕黃色或棕褐色一致性著色且陽性細(xì)胞率＞60%為陽性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS22.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料以百分率(%)表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；相關(guān)性采用Spearman 相關(guān)分析；以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組標(biāo)本中的EGFR、ALK 和p53 表達(dá)水平比較 EGFR 在肺腺癌的陽性表達(dá)在癌細(xì)胞胞膜或漿，呈棕褐色；ALK 在肺腺癌中的陽性表達(dá)在癌細(xì)胞胞漿，呈顆粒狀的棕褐色強(qiáng)著色；p53在肺腺癌中的陽性表達(dá)在細(xì)胞核，呈一致性的棕褐色強(qiáng)染色。EGFR、ALK和p53在肺腺癌組織中的陽性表達(dá)率均高于肺炎組織，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見表1和圖1。

2.2 肺癌組織中EGFR、ALK 和p53 的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系 EGFR 在肺腺癌組織中的表達(dá)與年齡無顯著性相關(guān)(P＞0.05)，但與性別、分化程度、臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)，在女性、中低分化、臨床分期為Ⅲ～Ⅳ期及有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的肺腺癌組織中EGFR的陽性表達(dá)率高于男性、高分化、臨床分期為Ⅰ～Ⅱ期及淋巴結(jié)無轉(zhuǎn)移的肺腺癌組織，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；ALK 和p53 在肺腺癌組織中的表達(dá)與年齡、性別無顯著性相關(guān)(P＞0.05)，但與肺腺癌分化程度、臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)，在中低分化、臨床分期為Ⅲ～Ⅳ期及有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的肺腺癌組織中，ALK、p53 的陽性表達(dá)率高于高分化、臨床分期為Ⅰ～Ⅱ期及淋巴結(jié)無轉(zhuǎn)移的肺腺癌組織，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見表2～表4。

表1 兩組標(biāo)本中的EGFR、ALK和p53表達(dá)水平比較[例(%)]

圖1 EGFR、ALK和p53在肺腺癌組織中的陽性表達(dá)(×100)

表2 EGFR的表達(dá)與肺腺癌不同臨床病理特征的關(guān)系(例)

表3 ALK的表達(dá)與肺腺癌不同臨床病理特征的關(guān)系(例)

表4 p53的表達(dá)與肺腺癌不同臨床病理特征的關(guān)系(例)

2.3 EGFR、ALK和p53在肺腺癌組織中表達(dá)的相關(guān)性 經(jīng)Spearman等級(jí)相關(guān)分析，EGFR和ALK在肺腺癌組織中的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(P＜0.05)。EGFR和p53在肺腺癌組織中的表達(dá)呈正相關(guān)(P＜0.05)。ALK和p53在肺腺癌組織中的表達(dá)呈正相關(guān)(P＜0.05)，見表5～表7。

表5 EGFR與ALK在肺腺癌組織中的表達(dá)及兩者的相關(guān)性(例)

表7 ALK與p53在肺腺癌組織中的表達(dá)及兩者的相關(guān)性(例)

3 討論

我國的肺癌發(fā)病率及死亡率近年來增長較快，且治愈率較低。國內(nèi)外學(xué)者在肺癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制及其藥物治療等方面做了大量研究，表明肺癌的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)涉及多因素多因子的復(fù)雜過程。找到影響肺癌預(yù)后的突變基因，評(píng)估這些突變基因?qū)Ψ伟╊A(yù)后的意義，并針對(duì)這些突變基因找到有效的靶向治療藥物十分重要。

EGFR是一個(gè)分子量為170 kDa的跨膜糖蛋白，其被配體激活后與許多惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)。大量研究表明EGFR的過表達(dá)及其基因突變?cè)诜伟?、乳腺癌、膀胱癌、肝癌、結(jié)直腸癌及膠質(zhì)瘤等腫瘤的發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用，與腫瘤預(yù)后和化療藥物的敏感性相關(guān)[11-12]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在肺腺癌組織中EGFR 的陽性表達(dá)率顯著高于肺炎組織，且與肺腺癌的分化程度、臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，在中低分化、臨床分期為中晚期和有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的肺腺癌組織中EGFR 的陽性表達(dá)率明顯增高。提示EGFR 的表達(dá)與肺腺癌的預(yù)后關(guān)系密切，其陽性表達(dá)隨肺腺癌的惡性程度增加而增加，可作為預(yù)后不良的參考指標(biāo)。在不吸煙或少吸煙的女性肺腺癌患者中EGFR基因突變比男性患者更常見。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果同樣顯示，女性患者肺腺癌組織中EGFR 的陽性表達(dá)率明顯高于男性患者，進(jìn)一步證實(shí)了這一結(jié)論。

ALK是一種Ⅰ型膜糖蛋白，正常僅在神經(jīng)系統(tǒng)中低水平表達(dá)，當(dāng)其發(fā)生基因重排或基因融合后，與肺非小細(xì)胞癌、間變性大細(xì)胞淋巴瘤、炎癥性肌纖維母細(xì)胞腫瘤等多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，被認(rèn)為是這些腫瘤的主要致瘤驅(qū)動(dòng)基因之一。非小細(xì)胞肺癌患者染色體的異位可使ALK基因與EML4基因發(fā)生融合，EML4-ALK 融合基因具有催化活性，被認(rèn)為是導(dǎo)致非小細(xì)胞肺癌發(fā)生發(fā)展的重要原因，且ALK基因與EML4基因發(fā)生融合的肺癌患者相較其他分子類型肺癌預(yù)后更差[13-15]。p53基因定位于17號(hào)染色體，當(dāng)其發(fā)生激活或缺失突變后，變成促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展的癌基因，與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)，可作為腫瘤預(yù)后的指標(biāo)之一[16]。有研究顯示，ALK與p53同時(shí)突變的肺癌患者比ALK與p53單突變的肺癌患者預(yù)后更差[17]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，ALK和p53在肺腺癌組織中的陽性表達(dá)率明顯高于肺炎組織，且與患者分化程度、臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，在中低分化、臨床分期為中晚期及有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的肺腺癌組織中ALK 和p53的陽性表達(dá)率明顯增高，且ALK 和p53 雙陽性的均為臨床分期為中晚期且有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的肺腺癌患者，提示ALK 和p53 的陽性表達(dá)率會(huì)隨著肺癌的嚴(yán)重程度增加而增高，揭示ALK 和p53 的表達(dá)與肺腺癌的預(yù)后轉(zhuǎn)歸可能正向關(guān)聯(lián)，且證實(shí)了ALK 與p53同時(shí)突變的肺癌患者比ALK與p53單突變的肺癌患者預(yù)后更差。

對(duì)于EGFR、ALK 和p53 在肺腺癌中表達(dá)的相關(guān)性，目前研究結(jié)果不太一致，有研究認(rèn)為EGFR突變肺腺癌和ALK陽性肺腺癌是兩種相對(duì)獨(dú)立的、發(fā)病機(jī)制不同的肺腺癌的分子亞型[18]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，EGFR和ALK在肺腺癌組織中的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，推測(cè)EGFR和ALK 可能通過激活不同的信號(hào)通路導(dǎo)致肺腺癌的發(fā)生發(fā)展，兩條通路之間可能具有拮抗作用。EGFR和p53 在肺腺癌中的陽性表達(dá)呈正相關(guān)，ALK 和p53在肺腺癌中的陽性表達(dá)呈正相關(guān)。推測(cè)EGFR、ALK與p53在肺腺癌的發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移中可能具有協(xié)同作用，共同促進(jìn)肺腺癌的發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移。

綜上所述，EGFR、ALK 和p53 在肺腺癌中的表達(dá)均高于肺炎組織，且與肺腺癌的嚴(yán)重程度呈正向關(guān)聯(lián)，EGFR、ALK 和p53 的陽性表達(dá)提示預(yù)后不良，在肺腺癌預(yù)后評(píng)估中具有重要參考價(jià)值，且三者的表達(dá)具有相關(guān)性，可能在肺癌發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移過程中相互協(xié)同、相互調(diào)節(jié)。針對(duì)這些蛋白的表達(dá)評(píng)估肺腺癌患者的預(yù)后，有選擇性的使用靶向治療藥物，對(duì)肺腺癌患者的治療及預(yù)后評(píng)估具有重要意義。