張迪，夏藝，范麗，劉士遠(yuǎn)，管宇

(海軍軍醫(yī)大學(xué)附屬長(zhǎng)征醫(yī)院，上海 200003)

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease， COPD)是一種慢性氣道炎性病變，以持續(xù)氣流受限為特征。據(jù)預(yù)測(cè)，COPD將在2020年成為全球主要死亡原因第三位及世界疾病經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)第五位[1-3]。COPD主要由吸煙、二手煙暴露、燃料燃燒產(chǎn)生的煙霧、基因因素等導(dǎo)致[4]。COPD呈進(jìn)行性發(fā)展，即使戒煙，病情仍然會(huì)進(jìn)一步惡化,但早期診斷干預(yù)可以有效延緩病程。目前缺乏COPD早期診斷及治療的有效手段，為解決這一問(wèn)題，需要進(jìn)一步了解COPD病程中的病理生理變化。COPD動(dòng)物模型可在短期內(nèi)呈現(xiàn)出疾病特點(diǎn)，有助于揭示早期COPD發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的動(dòng)態(tài)變化。因此，越來(lái)越多的學(xué)者致力于構(gòu)建穩(wěn)定的、與人類病理生理變化類似的動(dòng)物模型。

被用來(lái)制作COPD模型的動(dòng)物有很多種，如豚鼠、小鼠、大鼠、猴、羊、牛、豬等[5]。其中大鼠可在煙熏等誘因下快速構(gòu)建穩(wěn)定模型，且呈現(xiàn)出與人類相似的病程，因此被廣泛應(yīng)用[6-7]。由于吸煙是COPD的主要誘因，在多種COPD動(dòng)物模型建立方法中，煙熏模型表現(xiàn)出與人類患者最相似的病理生理特征，包括氣道炎癥、肺氣腫、氣道重塑和肺功能受損等。煙熏模型應(yīng)用廣泛，但造模方法(如實(shí)驗(yàn)中香煙種類、數(shù)量、煙熏頻率、總時(shí)間等)缺乏統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，使研究間的比較相對(duì)困難，實(shí)驗(yàn)的可重復(fù)性不佳，蛋白酶模型也存在這一不足。不同造模方法的結(jié)合同樣需要標(biāo)準(zhǔn)指導(dǎo)實(shí)驗(yàn)，以滿足不同的實(shí)驗(yàn)需求。此外，目前缺乏不同造模方法的對(duì)比研究，造模方法的選擇存在困難。

本研究擬采用煙熏、氣管內(nèi)滴注蛋白酶以及兩者結(jié)合的方式分別建立COPD大鼠模型，對(duì)比三者的造模效果，以期為COPD的研究提供穩(wěn)定可靠的建模方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雄性II級(jí)Wistar大鼠140只，體重(190 ± 10)g，周齡6 ～ 7周，由海軍軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物中心提供【SCXK(滬)2018-0006】，飼喂設(shè)施由中國(guó)人民解放軍海軍醫(yī)學(xué)研究所【SYXK(軍)2017-0041】提供。飼養(yǎng)環(huán)境溫度控制在(22 ± 2)℃，正常飼養(yǎng)7 d后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。隨機(jī)分為4組：⑴正常對(duì)照組n=20；⑵煙熏組n=60；⑶蛋白酶組n=30；⑷蛋白酶+煙熏組n=30。

1.1.2 試劑與儀器

彈性蛋白酶(南京奧多福尼生物科技有限公司，中國(guó))，香煙(大前門(mén)，焦油含量10 mg/根)，1%戊巴比妥鈉(天津蘭洪新能源科技有限公司，CAS：57-33-0)，4%多聚甲醛溶液(武漢楚江浩宇化工科技發(fā)展有限公司，CAS：30525-89-4)，0.9%氯化鈉溶液(華潤(rùn)雙鶴藥業(yè)股份有限公司，CAS號(hào)：7647-14-5)，無(wú)水乙醇(上海處泰化工科技有限公司，CAS號(hào) 64-17-5)，純凈水等。

微型計(jì)算機(jī)D7K67PA(惠普，美國(guó))，SCANCO uCT80 Micro-CT(SCANCO medical AG，瑞士)。

1.2 方法

1.2.1 體重測(cè)量

每周測(cè)量大鼠的體重，監(jiān)測(cè)各組大鼠體重動(dòng)態(tài)變化規(guī)律。

1.2.2 建立模型

煙熏組使用PAB-S200被動(dòng)吸煙動(dòng)物染毒系統(tǒng)(煙熏箱大?。?0 cm × 60 cm × 58 cm)及香煙進(jìn)行造模。煙熏過(guò)程中使用試管及抽吸裝置對(duì)大鼠進(jìn)行間歇煙霧暴露，模擬人類吸煙過(guò)程中煙霧暴露模式。每次煙熏同時(shí)點(diǎn)燃香煙20根，直至完全燃燒且煙霧基本散盡，共持續(xù)40 min，每天煙熏2次，兩次間隔時(shí)間不少于4 h，一周煙熏6 d。

將蛋白酶組大鼠頸部皮膚及肌肉分離，暴露主氣管，使用注射器向主氣管內(nèi)滴注彈性蛋白酶一次，劑量為50 IU/100 g。蛋白酶+煙熏組將氣管滴注蛋白酶與煙熏相結(jié)合，氣管內(nèi)滴注彈性蛋白酶(50 IU/100 g)后第二天起，按煙熏組的方法進(jìn)行煙熏處理。

1.2.3 標(biāo)本制備

煙熏組于煙熏24 h，1、2、4、8、12、16、20、24周處理大鼠各5只，對(duì)照組于對(duì)應(yīng)時(shí)間處理大鼠各2只，蛋白酶+煙熏組于煙熏24 h，1、2、4、8、12周處理大鼠各5只，蛋白酶組于相應(yīng)時(shí)間處理大鼠各5只。經(jīng)氣管向兩側(cè)肺內(nèi)反復(fù)緩慢注入并抽回生理鹽水共4.5 mL左右，進(jìn)行支氣管肺泡灌洗。離體肺標(biāo)本用4%多聚甲醛溶液固定48 h后進(jìn)行乙醇梯度脫水獲得干燥肺標(biāo)本(圖1)。

圖1 脫水后的干燥肺標(biāo)本Figure 1 Dried lung specimen after dehydration

1.2.4 標(biāo)本Micro-CT檢查及圖像分析

肺標(biāo)本行Micro-CT檢查。Micro-CT掃描參數(shù)：管電壓70 kV，管電流144 μA，分辨率18 μm。主觀評(píng)價(jià)CT圖像是否出現(xiàn)肺大泡，肺密度減低，炎癥等COPD表現(xiàn)，并記錄出現(xiàn)時(shí)間。

1.2.5 標(biāo)本病理學(xué)檢查及圖像分析

標(biāo)本經(jīng)石蠟包埋后，每個(gè)肺葉選取3張切片，行HE染色，鏡下觀察標(biāo)本是否出現(xiàn)肺泡擴(kuò)張、融合，間隔變窄、斷裂等改變，并記錄出現(xiàn)時(shí)間。

肺泡灌洗液1500 r/min離心10 min，留取上清液。采用大鼠白細(xì)胞介素-10(interleukin-10，IL-10)及基質(zhì)金屬蛋白酶-9(matrix metalloprotein-9, MMP-9)ELISA 試劑盒(深圳欣博盛生物科技有限公司)檢測(cè)細(xì)胞因子IL-10、MMP-9水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 21.0軟件。比較組間體重及細(xì)胞因子差異時(shí)，若數(shù)據(jù)分布符合正態(tài)分布，采用方差分析；否則采用Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)。以P< 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 體重

對(duì)4組大鼠進(jìn)行體重測(cè)量，結(jié)果如圖2、3所示。與對(duì)照組相比，煙熏組大鼠及蛋白酶+煙熏組大鼠體重增長(zhǎng)緩慢，第7周起煙熏組、蛋白酶+煙熏組大鼠體重增長(zhǎng)值與對(duì)照組出現(xiàn)差異(P< 0.05)。蛋白酶組與對(duì)照組體重增長(zhǎng)無(wú)顯著差異，但蛋白酶組大鼠1 ～ 4周體重增長(zhǎng)較對(duì)照組稍緩慢。

2.2 細(xì)胞因子

本研究中蛋白酶組及蛋白酶+煙熏組大鼠第24 h、1、2、4周IL-10水平顯著低于對(duì)照組(P< 0.05，圖4)。蛋白酶組及蛋白酶+煙熏組第24 h MMP-9濃度顯著大于對(duì)照組(P< 0.05)，此后，蛋白酶組及蛋白酶+煙熏組MMP-9濃度與對(duì)照組雖無(wú)顯著差異，但較對(duì)照組稍高(圖5)。煙熏組及對(duì)照組間IL-10及MMP-9未見(jiàn)明顯差異。

2.3 Micro-CT及病理

對(duì)照組Micro-CT圖像及病理圖像均未見(jiàn)明顯異常(圖6a)，蛋白酶組、蛋白酶+煙熏組第4周及煙熏組第8周Micro-CT圖像均可見(jiàn)肺大泡，局部肺組織密度減低，部分可見(jiàn)炎癥，肺內(nèi)病變分布均勻(圖6b1-d1紅色箭頭標(biāo)注部分)；病理圖像均可見(jiàn)肺泡擴(kuò)張，間隔變窄，部分肺泡間隔斷裂，肺泡融合等(圖6b2-d2黑色箭頭標(biāo)注部分)。四組Micro-CT結(jié)果與病理結(jié)果一致。

圖2 煙熏組大鼠及對(duì)照組大鼠體重變化Figure 2 Weight gain changes in the smoking group and the control group

圖3 蛋白酶組、蛋白酶+煙熏組及對(duì)照組大鼠體重變化Figure 3 Weight gain changes in the protease group, the smoking + protease group and the control group

圖4 四組大鼠IL-10水平變化Figure 4 Changes of IL-10 concentrations in the four groups

圖5 四組大鼠MMP-9水平變化Figure 5 Changes of MMP-9 concentrations in the four groups

注：a：正常對(duì)照組；b：煙熏組；c：煙熏+蛋白酶組；d：蛋白酶組。紅色箭頭：肺大泡，局部肺組織密度減低，可見(jiàn)炎癥；黑色箭頭：肺泡擴(kuò)張，間隔變窄，部分肺泡間隔斷裂，肺泡融合。圖6 四組大鼠Micro-CT及病理表現(xiàn)(HE染色，對(duì)照組×200，其他×400)Note. a, Control group. b, Smoking group. c, Smoking+protease group. d, Protease group. Red arrow: pulmonary bullous, reduced density of lung and inflammation. Black arrow: alveolar ectasia, alveolar fusion and alveolar septal destruction.Figure 6 Micro-CT images and photographs of HE-stained lung tissue under optical microscopes (control group, ×200; others, ×400)

3 討論

理想的動(dòng)物模型需表現(xiàn)出人類疾病的特點(diǎn)，盡可能使模型發(fā)病機(jī)理與人類疾病同源，此外還需滿足模型制備可重復(fù)性高，動(dòng)物成活率高等條件。目前尚無(wú)理想COPD動(dòng)物模型。嚙齒類動(dòng)物、猴、羊、狗等均可用于COPD動(dòng)物模型制備，其中大鼠因基因、行為特征及易進(jìn)行實(shí)驗(yàn)干預(yù)的特點(diǎn)成為建造COPD模型，模擬人類COPD病程的常用動(dòng)物。

大鼠是否適用于COPD造模仍存在爭(zhēng)議。有研究報(bào)道大鼠不易誘發(fā)產(chǎn)生COPD[8]，也有研究顯示，僅需2個(gè)月的煙熏就可觀測(cè)到大鼠的肺氣腫改變[9]。人類對(duì)COPD并不易感，需多年的煙熏才會(huì)造成COPD。因此，造模時(shí)間并非選擇造模動(dòng)物的決定性因素。

COPD造模方法有很多，如煙熏、蛋白酶或脂多糖氣管滴注、基因水平造模等[10-12]。本研究選擇較常用的煙熏、氣管滴注蛋白酶及兩者相結(jié)合的造模方法。煙熏造模效果與香煙類型，煙霧暴露方法及暴露時(shí)間有關(guān)，但三者均無(wú)統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)[13-14]。Churg等[15]研究表明產(chǎn)生肺氣腫需6個(gè)月，而Leberl等[9]只需2個(gè)月。本研究采用大前門(mén)香煙(焦油含量每根10 mg)及全身暴露的模式對(duì)大鼠進(jìn)行煙熏。蛋白酶—抗蛋白酶失衡學(xué)說(shuō)是COPD發(fā)病機(jī)制的經(jīng)典學(xué)說(shuō)，基于此，彈性蛋白酶被廣泛應(yīng)用于COPD模型制作。本研究采用氣管內(nèi)滴注彈性蛋白酶(南京奧多福尼生物科技有限公司)的方法進(jìn)行造模。

有研究表明IL-10分布廣泛，可抑制炎癥反應(yīng)[16-17]。其在COPD病程中的變化過(guò)程及作用目前仍存在爭(zhēng)議。曾華東等[18]對(duì)支氣管肺泡灌洗液細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，并測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-10含量，結(jié)果表明COPD組與對(duì)照組無(wú)明顯差異。有研究[19]認(rèn)為COPD組與正常對(duì)照組間血清IL-10水平亦無(wú)顯著差異。但也有研究[20]發(fā)現(xiàn)與正常對(duì)照組相比，COPD患者血清IL-10水平下降，說(shuō)明IL-10參與COPD炎癥反應(yīng)。梁柱等人發(fā)現(xiàn)肺泡灌洗液中COPD組IL-10水平明顯高于對(duì)照組[21]。本研究對(duì)煙熏組及對(duì)照組的支氣管肺泡灌洗液IL-10水平進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)兩組間無(wú)顯著差異。而蛋白酶組及蛋白酶+煙熏組大鼠24 h、1、2、4周IL-10水平顯著低于對(duì)照組。這可能因?yàn)?4 h～4周蛋白酶產(chǎn)生炎癥導(dǎo)致IL-10水平下降，隨后蛋白酶逐漸降解，炎癥消退。因存在檢測(cè)誤差或試劑盒靈敏度不夠可能，不能排除煙熏導(dǎo)致炎癥可能。MMP-9為促炎細(xì)胞因子，可分解氣道和肺組織的細(xì)胞外基質(zhì)及基底膜，參與氣道和肺組織的重塑過(guò)程。Li等[22]分析923名COPD患者及641名健康受檢者細(xì)胞因子水平，發(fā)現(xiàn)COPD患者血清MMP-9水平顯著高于健康對(duì)照組。Aneta等[23]的研究表明 COPD患者痰液中MMP-9水平亦高于健康對(duì)照組。本研究中煙熏組與對(duì)照組MMP-9水平雖無(wú)顯著差異，但從第8周開(kāi)始，煙熏組MMP-9水平均較對(duì)照組高。表明煙熏組MMP-9存在升高趨勢(shì)，支持煙熏導(dǎo)致氣道炎癥。蛋白酶組及蛋白酶+煙熏組24 h的MMP-9濃度顯著大于對(duì)照組，此后，蛋白酶組及蛋白酶+煙熏組MMP-9濃度與對(duì)照組雖無(wú)顯著差異但較對(duì)照組稍高。細(xì)胞因子檢測(cè)結(jié)果表明蛋白酶致炎作用較煙熏顯著，可誘導(dǎo)大鼠產(chǎn)生急性炎癥；煙熏誘導(dǎo)的炎癥發(fā)展緩慢，與人類COPD更相似。

COPD患者常存在體重減輕，而體重減輕可能會(huì)對(duì)COPD患者肌肉功能、健康狀態(tài)甚至預(yù)后產(chǎn)生影響[24-25]。本研究對(duì)大鼠體重進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)煙熏組大鼠及蛋白酶+煙熏組大鼠體重增長(zhǎng)較對(duì)照組緩慢，這與臨床患者表現(xiàn)一致。COPD患者體重減輕原因很多，如炎癥[26]，肌肉修復(fù)能力受損[27]，低氧血癥及二氧化碳潴留引起厭食[28]等。

CT是診斷COPD的重要手段，可直接觀察COPD形態(tài)學(xué)改變，并在吸煙者肺功能受損前發(fā)現(xiàn)肺部損害[29]。其中Micro-CT分辨率達(dá)到微米級(jí)別，可無(wú)創(chuàng)、清晰的觀測(cè)樣本內(nèi)部顯微結(jié)構(gòu)，展示疾病動(dòng)態(tài)過(guò)程。本研究使用Micro-CT與病理聯(lián)合評(píng)估大鼠肺部改變，發(fā)現(xiàn)第4周蛋白酶組、蛋白酶+煙熏組及第8周煙熏組出現(xiàn)COPD表現(xiàn)，同時(shí)4周蛋白酶+煙熏組Micro-CT及病理改變程度均高于蛋白酶組。說(shuō)明煙熏法、蛋白酶氣管滴注法及兩者相結(jié)合構(gòu)建大鼠COPD模型分別需8周、4周及4周。此外，蛋白酶+煙熏法誘導(dǎo)COPD病變程度高于蛋白酶滴注法。

Micro-CT與病理同步觀測(cè)到模型大鼠肺部改變，表明Micro-CT對(duì)肺部改變非常靈敏，可用于無(wú)創(chuàng)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)肺部病理變化?？傊?，本研究表明使用煙熏、蛋白酶及蛋白酶+煙熏的方法均可成功構(gòu)建大鼠COPD模型。煙熏大鼠模型可更好的模擬人類COPD病程，蛋白酶模型更加快速高效，而蛋白酶+煙熏模型更適于快速模擬中重度COPD。Micro-CT可靈敏真實(shí)的反應(yīng)肺部病理改變。

致謝感謝于志峰博士(上海市第九人民醫(yī)院)提供圖像后處理幫助。