徐正為，王 欣*

（江蘇省淮安市清江浦區(qū)疾病預(yù)防控制中心，江蘇 淮安 223000）

為了確保檢驗質(zhì)量，提高檢測能力，我實驗室每年定期進行外部質(zhì)控和內(nèi)部質(zhì)控。其中外部質(zhì)控主要為省、市疾控等部門下發(fā)的盲樣考核，內(nèi)部質(zhì)控由本單位組織的人員比對，儀器比對，平行試驗等[1]。現(xiàn)對2019年完成市疾控下發(fā)的微生物盲樣考核工作匯報如下。

1 材料與方法

1.1 樣品

淮安市疾控中心下發(fā)的混合菌株盲樣，編號為01-WS-01，3ml螺口塑料管包裝，檢測項目為致病菌分離鑒定。

1.2 儀器設(shè)備

隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱、生化培養(yǎng)箱、厭氧培養(yǎng)箱、顯微鏡、生物安全柜、壓力蒸汽滅菌器等。

1.3 培養(yǎng)基和試劑

沙門氏菌屬診斷血清（60種）購自寧波天潤；標(biāo)準(zhǔn)菌株鼠傷寒沙門氏菌、金黃色葡萄球菌購自廣東環(huán)凱；其余均購自青島海博，都在有效期內(nèi)。

1.4 檢驗方法

2019年國家食品污染物和有害因素風(fēng)險監(jiān)測工作手冊 (下卷)[2]；食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)GB4789。

2 實驗與結(jié)果

2.1 增菌與分離

挑取混合菌株盲樣,加入增菌液中培養(yǎng)后，轉(zhuǎn)種相應(yīng)培養(yǎng)基，具體如下。

2.1.1 BPW36℃18h，轉(zhuǎn)種TTB42℃24h、SC36℃24h。劃線接種于BS瓊脂、沙門氏菌屬顯色平板，36℃分別培養(yǎng)48h，24h。BS瓊脂上可見黑色有金屬光澤，周圍呈棕黑色菌落；沙門氏菌屬顯色平板上可見紫色菌落。

2.1.2 志賀氏菌增菌肉湯41.5℃20h厭氧培養(yǎng)，劃線接種于志賀氏菌顯色平板，36℃24h，未見可疑菌落生長。

2.1.3 營養(yǎng)肉湯36℃6h，轉(zhuǎn)種腸道菌增菌肉湯42℃18h。劃線接種于EMB平板，36℃24h，未見可疑菌落生長。

2.1.4 3%Nacl堿性蛋白胨水36℃18h，劃線接種于弧菌顯色平板，36℃24h，未見可疑菌落生長。

2.1.5 改良磷酸鹽緩沖液26℃72h，劃線接種于CIN-1瓊脂平板、改良Y瓊脂平板，26℃48h，未見可疑菌落生長。

2.1.6 7.5%Nacl肉湯36℃24h，劃線接種于Baird-Parker平板、血平板，36℃24h。Baird-Parker平板上可見光滑、凸起、灰黑色、周圍繞以不透明圈菌落。血平板上可見兩種菌落：①白色、無溶血圈；②黃色、有透明溶血圈。

2.1.7 改良胰蛋白胨大豆肉湯36℃24h，劃線接種于哥倫比亞CNA血瓊脂平板，36℃24h厭氧培養(yǎng)，未見可疑菌落生長。

2.1.8 劃線接種于MYP平板，30℃48h，未見可疑菌落生長。

2.1.9 LB1增菌液30℃24h，轉(zhuǎn)種LB2增菌液30℃24h。劃線接種于PALCAM平板、李斯特氏菌顯色平板，36℃48h，未見可疑菌落生長。

2.1.10 BPW36℃18h，轉(zhuǎn)種mLST-Vm肉湯44℃24h。劃線接種于阪崎腸桿菌顯色平板，36℃24h，未見可疑菌落生長。

2.1.11 SCDLP36℃24h，劃線接種于十六烷三甲基溴化銨平板，36℃24h，未見可疑菌落生長。

2.2 初步生化試驗

分別挑取BS瓊脂、沙門氏菌屬顯色平板、血平板、Baird-Parker平板上可疑菌落做革蘭氏染色鏡檢，并接種三糖鐵瓊脂，36℃培養(yǎng)24h，結(jié)果見下表。

2.3 進一步生化試驗及血清學(xué)鑒定

2.3.1 針對可疑為沙門氏菌屬的菌落，做以下實驗。用鼠傷寒沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株做陽性對照，同時做陰性對照。

2.3.1.1 挑取革蘭氏染色為陰性桿菌的菌落接種營養(yǎng)瓊脂平板，36℃培養(yǎng)24h后，做生化試驗，結(jié)果如下：

靛基質(zhì)-；衛(wèi)矛醇+；PH7.2尿素-；山梨醇+；KCN-；水楊苷-；賴氨酸脫羧酶+；甘露醇+；ONPG-；丙二酸鹽-；動力+

陽性對照：試驗結(jié)果與該菌一致

陰性對照：-

2.3.1.2 血清學(xué)鑒定：挑取2.3.1.1中營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)物與沙門氏菌屬診斷血清做玻片凝集試驗。凝集結(jié)果為：

A～F 多 價O 血 清：+++；O 7：+++；H 多價3：++；Hk：++

陽性對照：A～F多價O血清：+++

陰性對照：-

2.3.1.3 位相變異試驗（簡易平板法）：將半固體瓊脂平板烘干表面水分，挑取Hk因子血清1環(huán)滴在其表面，待血清吸收到瓊脂內(nèi)，在血清部位的中央點種待檢菌株，培養(yǎng)后，在蔓延生長的菌苔邊緣取菌繼續(xù)做H抗原第二相血清學(xué)鑒定，凝集結(jié)果為：

H多價4：+；H1,2,3,5：+；H5：+

陰性對照：-

2.3.1.4 根據(jù)凝集結(jié)果，查GB4789.4-2016附錄B《常見沙門氏菌抗原表》，判斷該菌為：湯卜遜沙門氏菌O：7；H：K：5

2.3.2 針對可疑為葡萄球菌屬的菌落，做血漿凝固酶實驗。用金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株作為陽性對照，同時做陰性對照，

2.3.2.1 挑取革蘭氏染色為陽性球菌的菌落，接種到5mLBHI肉湯，36 ℃培養(yǎng)24h。取新鮮兔血漿0.5mL，放入小試管中，再加入BHI肉湯培養(yǎng)物0.3mL，搖勻，置36℃溫箱內(nèi)，每半小時觀察一次。

觀察結(jié)果：1小時出現(xiàn)凝固；血漿凝固酶試驗：+

陽性對照結(jié)果：+

陰性對照結(jié)果：-

2.3.2.2 根據(jù)菌落特征、染色鏡檢、血漿凝固酶試驗結(jié)果，可判定該菌為：金黃色葡萄球菌。

2.4 結(jié)果報告

在混合菌株盲樣01-WS-01中檢出：湯卜遜沙門氏菌O：7；H：K：5和金黃色葡萄球菌。

3 討論

混合菌株培養(yǎng)時，往往優(yōu)勢菌生長旺盛，掩蓋弱勢菌的生長，需要實驗人員用強、弱性等不同選擇性平板，仔細(xì)觀察菌落的大小、溶血性、色澤等，不同類型菌落可在平板背面用筆圈出，通過革蘭氏染色和三糖鐵瓊脂斜面做初步的鑒別，觀察其是否為同一種菌，避免漏檢。在沙門氏菌血清學(xué)鑒定時，首先要排除是否有自凝現(xiàn)象，然后本著先多價后單價、先O抗原再H抗原的原則進行凝集。當(dāng)H抗原的第一相或第二相不凝集時，可用半固體、Swarm瓊脂進行誘導(dǎo)。實驗中要注意無菌操作，做好生物安全防護，既要避免外部雜菌混入，又要防止致病菌擴散[3]，相關(guān)操作均在生物安全柜中進行，廢棄物經(jīng)過高壓滅菌后按醫(yī)療廢棄物處理。

本次考核反饋的結(jié)果為滿意。實驗室的質(zhì)量控制是長期、系統(tǒng)的工作，包括從試劑的購買、驗收和保存，儀器檢定與保養(yǎng)，人員的操作規(guī)范及經(jīng)驗積累等各個環(huán)節(jié)。實驗人員需做好外部和內(nèi)部的質(zhì)量控制，總結(jié)經(jīng)驗教訓(xùn)，提高檢測能力，才能保證日常檢驗結(jié)果的準(zhǔn)確與可靠。