張 帥，郝 雪，王 悅，辛嘉英

(哈爾濱商業(yè)大學 黑龍江省普通高等學校食品科學與工程重點實驗室，哈爾濱 150076)

甲烷氧化菌(Methanotroph)是廣泛存在于自然界中的一種能夠以甲烷、甲醇等單碳化合物為碳源來進行生長的微生物[1]，它對于改善大氣中甲烷的平衡具有重要意義，可以預防并阻止日趨嚴重的溫室效應.此外，大量研究表明，甲烷氧化菌在生物可降解塑料、單細胞蛋白的合成、食品抗氧化劑、食品安全檢測、三氯乙烯等有機成分的降解以及提供清潔能源等方面也表現(xiàn)出了相當大的潛力[2～5].甲烷氧化菌的代謝主要依靠一種叫甲烷單加氧酶(Methane monooxygenase，MMO)的物質(zhì)，甲烷在它的作用下被催化氧化而生成甲醇[6].甲醇脫氫酶(Methanol dehydrogenase，MDH)又將生成的甲醇繼續(xù)氧化成甲醛，依賴于甲醛脫氫酶(Formaldehyde dehydrogenase，F(xiàn)DAH)和甲酸脫氫酶(Formate dehydrogenase，F(xiàn)DH)的作用最終使甲醛徹底氧化分解為CO2和H2O，同時通過絲氨酸循環(huán)或磷酸戊糖途徑完成細胞合成，為細胞代謝提供還原物質(zhì)[7].

在甲烷氧化菌的研究中發(fā)現(xiàn)存在一種小分子的熒光肽，它以分泌物的形式存在于甲烷氧化菌細胞外，同時又可以進入細胞內(nèi)膜參與顆粒性甲烷單加氧酶的形成[8].2004年這種熒光肽的結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)被發(fā)表，由7個氨基酸組成，包含2個咪唑N和2個硫酰S的硫酰咪唑基團，可以與銅離子發(fā)生絡合[9].2008年該結(jié)構(gòu)又被進行了部分修正，原來的羥咪唑基團更改為酮咪唑基團，異丙酯結(jié)構(gòu)更改為甲基丁酰基結(jié)構(gòu).從此以后，該物質(zhì)也就被命名為甲烷氧化菌素(methanobacin, mb)[10].甲烷氧化菌素對銅具有較強的親和性，2004年Kim等人在研究甲烷氧化菌素結(jié)合銅的機理時，發(fā)現(xiàn)低濃度Cu有利于促進甲烷氧化菌素的積累.當提供大量的Cu時，會促使甲烷氧化菌素與pMMO結(jié)合在細胞內(nèi)膜上[11].另外，甲烷氧化菌素∶Cu=1∶1時，甲烷氧化菌素促進甲烷氧化菌的生長.同時，顆粒性甲烷單加氧酶一旦與甲烷氧化菌素分離，顆粒性甲烷單加氧酶會喪失活性，生長受到抑制.分析其原因，甲烷氧化菌可能會像其他能分泌嗜鐵素(siderophore)用于捕獲環(huán)境中鐵的細菌一樣具有捕獲銅的能力，而這種能力就來源于甲烷氧化菌素[12].此后，Choi等發(fā)現(xiàn)甲烷氧化菌細胞外的甲烷氧化菌素在結(jié)合銅后返回細胞內(nèi)膜，參與顆粒性甲烷單加氧酶的催化氧化過程.加快了反應中電子的流動性.甲烷氧化菌素還具有過氧化物酶和超氧化物歧化酶(SOD)活性，說明甲烷氧化菌素在顆粒性甲烷單加氧酶的催化氧化過程中將NADH等電子供體向顆粒性甲烷單加氧酶傳遞，清除氧化反應過程中產(chǎn)生的超氧陰離子自由基，對細胞起到保護作用[13].通過改變搖瓶法培養(yǎng)甲烷氧化菌的條件，采用大孔樹脂法對甲烷氧化菌素的靜態(tài)吸附及動態(tài)吸附后分離純化甲烷氧化菌素，找到最佳吸附甲烷氧化菌素效果，有望為甲烷氧化菌OB3b應用提供理論參考.

1 儀器與材料

1.1 儀器

立式高壓滅菌器(上海申安LDZX-50KB型)；恒溫振蕩器(哈爾濱東聯(lián)電子HZQ-D型)；紫外-可見分光光度計(日本島津UV-2550型)；高速離心機(德國賀默公司Z-366)；RV8V旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(德國IKA公司).

1.2 實驗材料

甲烷氧化菌OB3b(Methylosinus trichosporium OB3b)，由清華大學邢新會教授贈送；NMS培養(yǎng)基參照文獻[14]方法配制；甲烷(北京海普氣體有限公司)；大孔樹脂；甲醇，K2HPO4，KH2PO4·7H2O，NH4Cl，KNO3，硫酸銅等均為分析純(天津市天力化學試劑有限公司).

1.3 實驗方法

1.3.1 搖瓶法培養(yǎng)甲烷氧化菌

培養(yǎng)基選用甲烷氧化菌OB3b培養(yǎng)基的配制方法培養(yǎng)甲烷氧化菌OB3b，定容至3 L的容量瓶.用紗布和報紙包扎瓶口，將上述物品放入高壓滅菌鍋中滅菌，121 ℃滅菌20 min后，置于無菌操作臺上冷卻.按照10%接種量接種，用帶棉花的玻璃管膠塞封口.以甲烷作為碳源培養(yǎng)，采用真空抽氣法抽氣后置入甲烷.溫度30 ℃，180 r/min，空氣浴搖床中培養(yǎng)5 d，每24 h通入一次甲烷.

1.3.2 甲烷氧化菌素的制備分離純化

離心取上清液，柱層析前對大孔樹脂進行活化，過柱后用60%甲醇洗脫大孔樹脂中吸附的甲烷氧化菌素，將裝有甲烷氧化菌素提取液的燒瓶40 ℃，130 r/min旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，旋蒸多余的甲醇樣品冷凍干燥獲得甲烷氧化菌素.

1.3.3 不同裝液量對大孔樹脂靜態(tài)吸附培養(yǎng)甲烷氧化菌生長的影響

分別于3 L玻璃搖瓶中配制裝液量為1.2、1.3、1.4、1.5、1.6 L的不同體積的甲烷氧化菌OB3b培養(yǎng)基，加入等量已處理好的大孔樹脂.121 ℃滅菌20 min后按照10%接種量接種.30 ℃，180 r/min，空氣浴搖床中培養(yǎng)5 d，每24 h通入一次甲烷，每隔一天取出3 mL菌液，用紫外可見分光光度計測菌液600 nm吸光值.

1.3.4 不同裝液量對大孔樹脂動態(tài)吸附培養(yǎng)甲烷氧化菌生長的影響

分別于3 L玻璃搖瓶中配制裝液量為1.2、1.3、1.4、1.5、1.6 L的不同體積的甲烷氧化菌OB3b培養(yǎng)基，不加入大孔樹脂.121 ℃滅菌20 min后按照10%接種量接種.30 ℃，180 r/min，空氣浴搖床中培養(yǎng)5 d，每24 h通入一次甲烷，每隔一天取出3 mL菌液，用紫外可見分光光度計測菌液600 nm吸光值.

1.3.5 大孔樹脂靜態(tài)吸附法對吸附甲烷氧化菌素的影響

分別配制5瓶1.5 L的甲烷氧化菌OB3b培養(yǎng)基，每個培養(yǎng)基各加入等量已處理好的大孔樹脂，按照10%接種量接種甲烷氧化菌OB3b，30 ℃，180 r/min空氣浴搖床中培養(yǎng)，每24 h通入一次甲烷，每隔一天取出1瓶菌液對其產(chǎn)生甲烷氧化菌素進行分離純化，用紫外分光光度計掃描全波長，計算甲烷氧化菌素的濃度.

1.3.6 大孔樹脂動態(tài)吸附法對吸附甲烷氧化菌素的影響

分別配制5瓶1.5 L的甲烷氧化菌OB3b培養(yǎng)基，按照10%接種量接種甲烷氧化菌OB3b，30 ℃，180 r/min空氣浴搖床中培養(yǎng)，每24 h通入一次甲烷，每隔一天取出1瓶菌液對其發(fā)酵液進行分離純化產(chǎn)生甲烷氧化菌素，用紫外分光光度計掃描全波長，計算甲烷氧化菌素的濃度.

2 實驗結(jié)果與討論

2.1 不同裝液量對大孔樹脂靜態(tài)和動態(tài)吸附下甲烷氧化菌的生長結(jié)果

如圖1、2所示，1.2、1.3、1.4、1.5、1.6 L五種不同裝液量的培養(yǎng)基，在相同的培養(yǎng)條件下，分別進行1～5 d的培養(yǎng)后，可以看出1.2、1.3 L裝液量的甲烷氧化菌OB3b吸光值增加并不明顯，說培養(yǎng)基裝液量不足導致營養(yǎng)物質(zhì)不能滿足甲烷氧化菌OB3b的生長需求而生長緩慢；而1.4、1.5 L隨著裝液量的升高，菌體生長加快；1.6 L時，菌體生長反而下降，說明裝液量過多，導致留給菌體進行有氧呼吸的空間被縮小，抑制了菌體生長.故當培養(yǎng)基用量為1.5 L時，甲烷氧化菌OB3b的生長情況最好.另外，對比大孔樹脂靜態(tài)和動態(tài)吸附下培養(yǎng)甲烷氧化菌的生長結(jié)果發(fā)現(xiàn)，大孔樹脂靜態(tài)吸附的培養(yǎng)方式也優(yōu)于動態(tài)吸附.

圖1 不同裝液量在大孔樹脂靜態(tài)吸附方式培養(yǎng)甲烷氧化菌的生長曲線

圖2 不同裝液量在大孔樹脂動態(tài)吸附方式培養(yǎng)甲烷氧化菌的生長曲線

2.2 大孔樹脂靜態(tài)吸附法對吸附甲烷氧化菌素的影響結(jié)果

如圖3、4所示，1.5 L的培養(yǎng)基，在相同的培養(yǎng)條件下，分別進行1～5 d的培養(yǎng)后，可以看出，培養(yǎng)1～4 d所得到的甲烷氧化菌素進行紫外分光光度計的全波長掃描后，隨著培養(yǎng)時間的增加，甲烷氧化菌素在394 nm最大吸收峰對應增加，說明隨著甲烷氧化菌OB3b的生長速度加快，菌體數(shù)量增多，其向胞外釋放的甲烷氧化菌素量也逐漸增多，隨即很快就被培養(yǎng)基中的大孔樹脂所吸附.培養(yǎng)4 d后，甲烷氧化菌素開始減少，可能是由于在發(fā)酵液中甲烷氧化菌數(shù)量已達到最大值，部分菌體出現(xiàn)死亡，部分甲烷氧化菌素發(fā)生裂解破碎而無法被檢測到.故選擇4 d為甲烷氧化菌OB3b最佳吸附甲烷氧化菌素的培養(yǎng)時間.

圖3 大孔樹脂靜態(tài)吸附甲烷氧化菌素的全波長掃描

通過靜、動態(tài)兩種吸附方式比較發(fā)現(xiàn)，靜態(tài)吸附培養(yǎng)時，隨著時間的遞增，甲烷氧化菌素的394 nm吸收峰明顯.而在相同培養(yǎng)條件下動態(tài)吸附?jīng)]有明顯的吸收峰，說明靜態(tài)吸附培養(yǎng)條件下，更多的甲烷氧化菌素被吸附進入大孔樹脂而最后被分離出來.因此從紫外分光光度計檢測甲烷氧化菌素含量的角度來說，靜態(tài)吸附要優(yōu)于動態(tài)吸附.

圖4 大孔樹脂動態(tài)吸附甲烷氧化菌素的全波長掃描

3 結(jié) 語

本實驗分別對甲烷氧化菌OB3b在大孔樹脂靜態(tài)和動態(tài)吸附法的培養(yǎng)方式下，考察不同裝液量對菌體生長的影響，大孔樹脂靜態(tài)吸附和動態(tài)吸附法對吸附甲烷氧化菌素的影響.結(jié)果表明，培養(yǎng)基裝液量為1.5 L時，培養(yǎng)4 d，大孔樹脂靜態(tài)吸附的培養(yǎng)方式對甲烷氧化菌OB3b的生長較好.同時，靜態(tài)吸附下，大孔樹脂靜態(tài)吸附甲烷氧化菌素的量也更多，為今后提高甲烷氧化菌素的分離能力奠定了科學基礎(chǔ).