陳宏，梁艷，金穎莉，虞希沖，趙永忠，王維千，林青霞，林海西，楊闖

（1.溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院 精神衛(wèi)生科，浙江 溫州 325015；2.溫州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院 消化內(nèi)科，浙江 溫州 325027；3.溫州醫(yī)科大學 藥學院，浙江 溫州 325035）

精神分裂癥是一種涉及感知覺、思維、情緒和行為等多方面障礙以及精神活動不協(xié)調(diào)的重性精神疾病，臨床表現(xiàn)異質(zhì)性大，藥物治療轉(zhuǎn)歸欠佳[1]，然而發(fā)病機制尚不明確。近年來有關精神分裂癥谷氨酸受體功能紊亂假說受到足夠關注，認為谷氨酸受體缺陷導致谷氨酸能系統(tǒng)異常是精神分裂癥發(fā)生的重要原因，在此基礎上采用MK-801特異性阻斷谷氨酸受體能導致大/小鼠產(chǎn)生精神分裂癥患者類似的異常行為[2-3]。褪黑素（melatonin，MT）是由腦松果體合成分泌的一種吲哚類神經(jīng)內(nèi)分泌激素，具有調(diào)節(jié)機體晝夜節(jié)律、保護膽堿、抗氧化、抗炎等功效，參與體內(nèi)多種生理反應[4]。近年來，MT在神經(jīng)保護方面的作用受到重視，研究表明其能修復受損的神經(jīng)元突觸，促進神經(jīng)元間的信號交流，延緩神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生[5]。然而，MT能否影響精神分裂癥的發(fā)生發(fā)展進程，尚未見相關報道。本研究旨在觀察MT能否對精神分裂癥模型大鼠海馬神經(jīng)元產(chǎn)生保護作用，并探討其作用機制，為MT治療精神分裂癥提供實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物與主要試劑 雄性SD大鼠60只，6～8周齡，體質(zhì)量180～220 g，由上海斯萊克實驗動物有限公司提供，許可證號SCXK（滬）2017-0005。整個實驗期間大鼠均飼養(yǎng)在SPF級標準環(huán)境中，適應性喂養(yǎng)5 d后開始正式實驗。MT、Luzindole（美國Sigma公司）；雙氫羅丹明（DHR）-123試劑盒（上海碧云天公司）；SOD、MDA酶聯(lián)免疫試劑盒（南京建成公司）；兔抗大鼠核因子E2相關因子2（nuclear factor E2-elated factor 2，Nrf2）、血紅素加氧酶-1（heme oxygenase-1，HO-1）多克隆抗體（英國Abcam公司）；NeuN多克隆抗體（美國CST公司）；山羊抗兔IgG二抗（美國CST公司）。

1.2 造模和實驗分組 將大鼠隨機分為5組，包括對照組、模型組、模型+MT低劑量組、模型+MT高劑量組、模型+MT受體阻斷劑組，每組12只。除對照組大鼠外，其余均采用持續(xù)性腹腔注射MK-801的方法建立精神分裂癥大鼠模型[6]，注射劑量為每天0.6 mg/kg，持續(xù)注射14 d。通過SAMS-DODD刻板行為評分法[7]對造模大鼠進行評分，證實所有大鼠均造模成功。于實驗第15天開始給藥，其中模型+MT低劑量組和模型+MT高劑量組分別腹腔注射MT溶液12.5 mg/kg、25 mg/kg，模型+MT受體阻斷劑組腹腔注射Luzindole 1 mg/kg，對照組及模型組分別腹腔注射10%無水乙醇溶液，各組均給藥21 d。給藥完成后，所有大鼠進行行為學檢測，測試完成后麻醉大鼠，腹主動脈取血，并分離海馬組織進行后續(xù)指標檢測。

1.3 Morris水迷宮實驗 Morris水迷宮實驗分為兩部分。①定位航行實驗：于給藥第17天開始進行訓練，連續(xù)4 d，考察大鼠的學習能力；將大鼠從Morris水迷宮左下方平臺所在區(qū)域放入，放入時頭朝向池壁，待其自由游泳，找到并爬上平臺，并記錄時間（逃避潛伏期）；若大鼠在1 min內(nèi)未找到，則將其牽引至平臺，停留10 s后放回籠內(nèi)，其潛伏期時間記為60 s。②空間探索實驗：在連續(xù)4 d的學習后撤去平臺，將大鼠從水迷宮右上方面向池壁放入，記錄其在1 min內(nèi)穿越原平臺區(qū)域次數(shù)及在原平臺區(qū)域的停留時間（空間探索時間）。

1.4 氧化應激檢測方法 采用DHR-123試劑盒檢測大鼠海馬勻漿液中活性氧（reactive oxygen species，ROS）的相對水平，ELISA試劑盒檢測海馬勻漿液中超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）及丙二醛（malonic dialdehyde，MDA）的含量，實驗操作過程均按照試劑盒說明書進行。

1.5 免疫組織化學方法 取固定完全的海馬組織，經(jīng)石蠟包埋后切片，分別用75%、95%、100%梯度乙醇脫水、浸蠟、水化、沖洗、滴加山羊血清封閉液，在37 ℃孵育30 min，加一抗孵育過夜（1:100稀釋）；PBS洗3次，加二抗孵育15 min，沖洗，加DAB液染色，蘇木精復染，梯度乙醇脫水，封片。于顯微鏡下選擇4個視野，統(tǒng)計陽性細胞數(shù)量，取平均值。

1.6 Western blot方法 取冷凍保存的海馬組織，加入強力組織裂解液，冰上勻漿，離心，取上清液測定總蛋白含量。根據(jù)目的蛋白分子量制備分離膠和濃縮膠，蛋白變性，上樣，跑凝膠電泳，電泳完成轉(zhuǎn)膜，在室溫下用脫脂牛奶封閉1 h，裁剪條帶，加入稀釋后的Nrf2、HO-1一抗（1:1 000），4 ℃冰箱孵育過夜。采用TBST溶液洗滌條帶4次，每次15 min，加入二抗繼續(xù)孵育4 h，洗滌，化學發(fā)光法顯影。采用圖像分析軟件統(tǒng)計Nrf2和HO-1蛋白條帶灰度值，計算目的蛋白的相對表達水平。

1.7 統(tǒng)計學處理方法 采用SPSS21.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料用表示，多組間比較用單因素方差分析，組間兩兩比較用LSD-t法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組定位航行實驗結(jié)果比較 與對照組比，訓練第3天和第4天模型組逃避潛伏期時間明顯延長，差異有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）；與模型組比，訓練第3天和第4天模型+MT高劑量組的逃避潛伏期時間明顯縮短，差異有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）；與模型+MT高劑量組比，訓練第4天模型+MT受體阻斷劑組逃避潛伏期時間延長，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表1。

表1 各組定位航行實驗中逃避潛伏期時間比較（每組n=12，s）

表1 各組定位航行實驗中逃避潛伏期時間比較（每組n=12，s）

與對照組比：aP＜0.05；與模型組比：bP＜0.05；與模型+MT高劑量組比：cP＜0.05

組別 訓練第1天 訓練第2天 訓練第3天 訓練第4天對照組 52.24±10.27 48.71± 9.38 43.28±7.15 38.91±6.24模型組 56.91± 8.79 57.12± 9.29 56.14±8.97a 52.97±9.27a模型+MT低劑量組 57.25±10.24 55.27± 8.93 52.71±7.09 50.37±7.00模型+MT高劑量組 53.27± 8.09 47.13±10.52 44.92±8.04b 42.45±6.26b模型+MT受體阻斷劑組 56.74±10.01 56.08± 7.76 57.21±8.59 54.92±7.06c

2.2 各組空間探索實驗結(jié)果比較 與對照組比，模型組穿越平臺次數(shù)及停留時間均顯著減少，差異有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）；與模型組比，模型+MT低劑量組和模型+MT高劑量組原平臺區(qū)域的停留時間均顯著增加，差異有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）；與模型+MT高劑量組比，模型+MT受體阻斷劑組原平臺區(qū)域的停留時間顯著減少，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），見表2。

表2 各組空間探索實驗結(jié)果比較（每組n=12

表2 各組空間探索實驗結(jié)果比較（每組n=12

與對照組比：aP＜0.05；與模型組比：bP＜0.05；與模型+MT高劑量組比：cP＜0.05

組別 穿越原平臺區(qū)域次數(shù)（次）原平臺區(qū)域停留時間（s）對照組 6.32±1.02 24.37±3.91模型組 4.27±0.84a 13.09±2.66a模型+MT低劑量組 5.38±0.68 17.73±2.80b模型+MT高劑量組 5.97±0.80 22.31±3.77b模型+MT受體阻斷劑組 4.71±0.60 11.22±2.03c

2.3 各組海馬氧化應激因子水平比較 與對照組比，模型組海馬勻漿液中ROS、MDA含量顯著增加，SOD活性下降，差異有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）；與模型組比較，模型+MT高劑量組大鼠海馬ROS、MDA含量均下降，SOD活性升高，差異有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）；與模型+MT高劑量組比，模型+MT受體阻斷劑組ROS、MDA含量增加，差異有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），見表3。

2.4 各組大鼠海馬NeuN蛋白表達量比較 對照組大鼠海馬神經(jīng)元豐富，排列整齊有序；模型組大鼠海馬神經(jīng)元稀疏、排列散亂，部分神經(jīng)元胞體變大，呈空泡狀，NeuN陽性細胞數(shù)較對照組顯著減少，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；與模型組比，模型+MT高劑量組海馬NeuN陽性表達明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；與模型+MT高劑量組比，模型+MT受體阻斷劑組NeuN陽性細胞明顯減少，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），見圖1和表4。

2.5 各組大鼠海馬Nrf2、HO-1蛋白表達水平比較 與對照組比，模型組大鼠海馬Nrf2、HO-1蛋白表達均顯著上升，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；與模型組比，模型+MT高劑量組Nrf2、HO-1表達均顯著增加，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；與模型組比，模型+MT低劑量組Nrf2表達增加，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與模型+MT高劑量組比，模型+MT受體阻斷劑組Nrf2、HO-1表達水平均顯著下調(diào)，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。見表5。

表3 各組海馬氧化應激因子水平比較（每組n=6，

表3 各組海馬氧化應激因子水平比較（每組n=6，

與對照組比：aP＜0.05；與模型組比：bP＜0.05；與模型+MT高劑量組比：cP＜0.05

組別 ROS SOD（kU/L） MDA（μmol/g）對照組 41.72± 6.27 35.91±5.22 5.27±0.69模型組 98.17±11.04a 22.75±3.08a 12.97±2.60a模型+MT低劑量組 70.21±10.09b 24.28±3.67 9.78±1.26模型+MT高劑量組 57.58± 7.91b 29.17±3.10b 7.08±0.79b模型+MT受體阻斷劑組 119.72±13.80c 18.09±2.82 13.51±2.81c

圖1 大鼠海馬NeuN陽性細胞表達情況（免疫組織化學染色，×200）

表4 各組大鼠海馬NeuN陽性細胞數(shù)比較（每組n=6，

表4 各組大鼠海馬NeuN陽性細胞數(shù)比較（每組n=6，

與對照組比：aP＜0.05；與模型組比：bP＜0.05；與模型+MT高劑量組比：cP＜0.05

組別 陽性細胞數(shù)（個）對照組 43.71±5.67模型組 24.07±3.14a模型+MT低劑量組 29.73±2.53模型+MT高劑量組 38.29±5.26b模型+MT受體阻斷劑組 21.33±2.79c

表5 各組大鼠海馬Nrf2、HO-1蛋白表達水平比較（每組n=4±s）

表5 各組大鼠海馬Nrf2、HO-1蛋白表達水平比較（每組n=4±s）

與對照組比：aP＜0.05；與模型組比：bP＜0.05；與模型+MT高劑量組比：cP＜0.05

組別 Nrf2 HO-1對照組 0.14±0.03 0.18±0.02模型組 0.37±0.05a 0.35±0.04a模型+MT低劑量組 0.46±0.05b 0.43±0.05模型+MT高劑量組 0.63±0.07b 0.69±0.07b模型+MT受體阻斷劑組 0.29±0.04c 0.27±0.04c

3 討論

目前國際上認為，精神分裂癥的發(fā)生是由于N-甲基-D天冬氨酸（NMDA）受體功能障礙導致的。MK-801是NMDA受體的特異性阻斷劑，廣泛用于建立精神分裂癥動物模型，能引發(fā)嚙齒類動物認知功能障礙、活動遲緩或亢進、動作異常等與人類臨床發(fā)病類似的特征[8]。本研究中，MK-801持續(xù)注射后大鼠學習與記憶功能均明顯下降，海馬結(jié)構(gòu)受損，神經(jīng)元數(shù)量下降，均符合精神分裂癥動物模型的病理特點。

氧化應激是導致神經(jīng)元損傷的重要原因，其機制是外界刺激引起的機體氧化-抗氧化間的失衡，ROS大量累積，造成腦穩(wěn)態(tài)失調(diào)及細胞色素C過量釋放等，引發(fā)神經(jīng)炎癥和線粒體功能紊亂，神經(jīng)元損傷甚至凋亡[9-10]。研究表明，抑郁癥、阿爾茨海默癥、帕金森病等腦神經(jīng)精神疾病均與氧化應激損傷有關[11]。本研究發(fā)現(xiàn)，精神分裂癥模型大鼠海馬ROS和MDA含量均顯著增加，SOD活性下降，同時海馬神經(jīng)元稀疏，排列散亂，神經(jīng)元標志蛋白NeuN陽性表達較正常大鼠顯著降低，說明在精神分裂癥疾病狀態(tài)下，海馬遭受嚴重的氧化應激而導致神經(jīng)元損傷，認知功能障礙，表現(xiàn)出疾病的臨床特征；MT則能呈劑量依賴性地發(fā)揮抗氧化作用，保護海馬神經(jīng)元。

Nrf2是調(diào)控細胞對抗氧化應激損傷的關鍵轉(zhuǎn)錄因子。生理狀態(tài)下，Nrf2通常與其抑制物Keap1結(jié)合于胞漿中，未能進入細胞核發(fā)揮轉(zhuǎn)錄活性；而在氧化應激狀態(tài)下，Nrf2會與Keap1解離，進入到胞核中與抗氧化反應元件結(jié)合，從而啟動下游抗氧化蛋白、抗炎性因子、免疫因子等多種靶基因的轉(zhuǎn)錄[12]。HO-1是Nrf2調(diào)控的下游關鍵靶基因之一，主要在對抗氧化應激損傷中發(fā)揮重要作用[13]。研究表明，Nrf2基因敲除小鼠的抗氧化應激效應明顯減弱，H0-1活性降低，ROS水平升高[14]；在激活Nrf2相關通路后，能減輕阿爾茲海默癥大鼠海馬神經(jīng)元的損傷，發(fā)揮神經(jīng)保護作用[15]。在本研究中，模型大鼠海馬Nrf2、HO-1蛋白表達均顯著上升，表明大鼠在應對外源氧化應激損傷時啟動了內(nèi)源性保護機制，Nrf2蛋白核轉(zhuǎn)位，并促進下游抗氧化HO-1基因的轉(zhuǎn)錄及表達；MT治療后，Nrf2、HO-1表達進一步增加，說明MT能激活Nrf2/HO-1通路，而應對疾病狀態(tài)下的神經(jīng)元氧化應激損傷。

MT是由松果體分泌的一種內(nèi)源性激素，可通過矯正生物鐘和調(diào)節(jié)神經(jīng)內(nèi)分泌功能而發(fā)揮清除氧自由基、抗應激及延緩衰老等作用，臨床治療失眠療效顯著[16]。研究證實，在焦慮癥、抑郁癥、精神分裂癥、恐怖癥等與睡眠障礙有關的精神類疾病中均存在MT分泌不足的現(xiàn)象[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，MT能降低精神分裂癥大鼠氧化應激損傷，保護海馬神經(jīng)元，改善認知功能，其機制可能與調(diào)控Nrf2/HO-1信號通路有關；本研究還設置了MT受體阻斷劑組，發(fā)現(xiàn)在阻斷MT受體后，模型大鼠海馬神經(jīng)元損傷程度及認知障礙均更為嚴重。本研究提示MT在保護精神分裂癥大鼠神經(jīng)元氧化應激損傷中的重要作用，為其在該疾病的臨床應用提供一定的借鑒意義。