黃愛芳，王陳翔，金輝，葉其蓁，金蜜，周子曄

（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 藥學(xué)部，浙江 溫州 325015）

細(xì)胞色素P450（CYP450）是I相代謝酶[1]，其活力被干擾能影響藥物在體內(nèi)的轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致不良反應(yīng)和治療失敗[2]，這也是藥物相互作用的最常見原因。除藥物外，許多天然產(chǎn)物也會影響CYP450酶活性，如葡萄柚汁抑制特非那丁代謝導(dǎo)致中毒死亡[3]，金絲桃素影響環(huán)孢素A等藥物濃度導(dǎo)致治療失敗[4-7]。

枸杞多糖具有增強(qiáng)免疫力、清除氧自由基、降低膽固醇、控制血糖等功效，一直是研究熱點(diǎn)[8-9]。枸杞多糖在全世界范圍內(nèi)擁有數(shù)量龐大的服用人群，它與其他藥物的相互作用通常會被忽視，因此需要對其影響CYP450的能力進(jìn)行評估。

目前，還未見枸杞多糖影響CYP450酶的研究報道。本研究通過觀察枸杞多糖對大鼠CYP450酶活力和基因表達(dá)的調(diào)節(jié)作用，從而推測其對肝臟代謝合用藥物時的潛在影響。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物：SD大鼠36只，雄性，體質(zhì)量（260±25）g，由溫州醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供，生產(chǎn)許可證號：SCXK（浙）2015-0001。

1.1.2 試藥試劑：枸杞多糖（批號19062301，純度＞90%）購于凱瑪生化有限公司（天津）；非那西?。ㄅ朣TBB2177M9）和甲苯磺丁脲（批號078K0725）購于美國Sigma公司，純度均＞98%；安非他酮（批號100671-201802）、咪達(dá)唑侖（批號171250-200401）和地西泮（批號171225-200903）購自中國藥品生物制品檢定所（北京），純度均＞98%；乙腈、甲酸為色譜純；TriPure Isolation Reagent購于美國Roche試劑公司；RevertAid First Strand cDNA Synthesis試劑盒購于美國Thermo Scientific試劑公司；Power SYBR Green PCR Master Mix購于美國Applied Biosystems試劑公司；引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器：Waters XEVO TQ-S液相質(zhì)譜聯(lián)用儀，配有ACQUITY超高效液相色譜儀（UPLC）和電噴霧離子源（ESI）；Beckman DU640核酸和蛋白分析儀；BIO-RAD MyCycler熱循環(huán)儀；Applied Biosystems 7500 RT-PCR儀。

1.2 評估枸杞多糖對探針?biāo)幩巹訉W(xué)的影響

1.2.1 造模取樣：18只SD大鼠隨機(jī)平均分成高低兩劑量給藥組和對照組，低劑量組和高劑量組大鼠分別每日按250 mg/kg和500 mg/kg劑量灌胃枸杞多糖水溶液，對照組灌胃等體積純化水，灌胃操作持續(xù)14 d。在末次給藥后24 h同時給予4種探針?biāo)幬锏幕旌先芤?，含非那西丁、安非他酮和咪達(dá)唑侖（劑量5 mg/kg）及甲苯磺丁脲（劑量1 mg/kg），并在給藥后10、20、30、45 min和1、1.5、2、3、4、6、8、10、12、24、36 h，于大鼠尾部剪尾取血約300 μL置抗凝EP管中。于8 000 r/min，4 ℃離心10 min后，分離得100 μL血漿即刻處理或置于-20 ℃冰箱凍存。

1.2.2 血樣處理：100 μL血漿樣品中加入300 μL含有地西泮（50 ng/mL）的乙腈溶液沉淀蛋白，渦旋振蕩1 min，4 ℃，13 000 r/min離心10 min后，取100 μL上清液置于進(jìn)樣瓶中，設(shè)定1 μL進(jìn)樣UPLCMS/MS系統(tǒng)檢測。

1.2.3 檢測條件：Waters BEH色譜柱（2.1×100 mm，1.7 μm）；流速0.3 mL/min；柱溫30 ℃；流動相A為純化水（含0.1%甲酸），B為乙腈，梯度洗脫程序?yàn)椋?～2.0 min（50%～50% B），2.0～2.2 min（50%～90% B），2.2～2.5 min（90%～50% B），2.5～3.0 min（50%～50% B）。采用MRM監(jiān)測模式進(jìn)行定量，四種探針?biāo)幍臋z測離子對分別為非那西丁m/z 180.0→110.2、安非他酮m/z 240.0.1→184.0、甲苯磺丁脲m/z 269.1→170.0、咪達(dá)唑侖m/z 326→291.3和內(nèi)標(biāo)地西泮m/z 285.1→193.0。非那西丁和甲苯磺丁脲在50～10 000 ng/mL血藥濃度范圍內(nèi)，安非他酮和咪達(dá)唑侖在5～1 000 ng/mL血藥濃度范圍內(nèi)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，并進(jìn)行方法學(xué)評估。

1.3 評估枸杞多糖對CYP450亞型mRNA水平的改變

1.3.1 造模取樣：18只SD大鼠隨機(jī)平均分為對照組和低高劑量組，低劑量組和高劑量組分別每日按250 mg/kg和500 mg/kg劑量給予大鼠枸杞多糖水溶液，對照組給予等體積純化水，灌胃持續(xù)14 d。末次灌胃后24 h處死，在冰上迅速摘取肝組織凍存于-80 ℃冰箱。

1.3.2 RNA提?。捍笫蟾谓M織剪碎研磨后使用Tri-Pure試劑抽提大鼠肝組織總RNA，并在260 nm和280 nm波長條件下測量吸光度值。兩者比值在1.8和2.0之間可以認(rèn)為RNA純度符合要求，并且基于260 nm處的吸光度將RNA濃度調(diào)整至1 μg/μL，進(jìn)行cDNA反轉(zhuǎn)錄。

1.3.3 cDNA合成：cDNA合成體系包括RNA 1 μg，random hexamer primer 1 μL，5×Reaction buffer 4 μL，RiboLock RNase Inhibitor 1 μL，dNTP mix 2 μL，RebertAid M-MuLV Transcriptase 1 μL，nuclease-freewater 10 μL，總體積為20 μL。反轉(zhuǎn)錄程序?yàn)椋?5 ℃ 5 min，42 ℃ 60 min，70 ℃5 min終止反應(yīng)。由此反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA產(chǎn)物用于PCR擴(kuò)增或儲存在-20 ℃冰箱中備用。

1.3.4 PCR擴(kuò)增：20 μL PCR擴(kuò)增體系包括cDNA產(chǎn)物2 μL，2×SYBR Green PCR Master Mix 10 μL，20 mmol/L上下游引物各0.5 μL，nuclease-free water 7 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?0 ℃ 2 min；95 ℃10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min運(yùn)行40個循環(huán)。獲得樣本的CT值后，使用2-ΔΔCT法計算CYP450亞型實(shí)驗(yàn)組表達(dá)量與對照組表達(dá)量的比值。大鼠CYP450亞型和內(nèi)參引物序列如下：CYP1A2上游引物為5'-CACC TCACTGAATGGCTTCC-3'，下游引物為5'-TCTCACTCAGG GTCTTGTCG-3'；CYP2B1上游引物為5'-GGCCTCCTCAA TTCCTTC-3'，下游引物為5'-TGTCTGTCCCACATAGCA T-3'；CYP2C11上游引物為5'-TGATAGTATCGCTGTCAT CC-3'，下游引物為5'-CAAATCCACTGATAGCTGGT-3'；CYP3A1上游引物為5'-ATGGAGATCACAGCCCAGTC-3'，下游引物為5'-TAGGTGGGAGGTGCCTTATT-3'；內(nèi)參β-actin上游引物為5'-AGAGGGAAATCGTGCGTGAC-3'，下游引物為5'-TTCTCCAGGGAGGAAGAGG-3'。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理方法 通過DAS 2.0軟件計算藥動學(xué)參數(shù)并使用SPSS19.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。藥動學(xué)參數(shù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，如參數(shù)呈正態(tài)分布，組間數(shù)據(jù)以表示并采用單因素方差分析進(jìn)行比較，如參數(shù)呈非正態(tài)分布，組間數(shù)據(jù)以中位數(shù)表示并采用非參數(shù)檢驗(yàn)進(jìn)行比較。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 枸杞多糖改變CYP450酶活力 探針?biāo)幣c內(nèi)標(biāo)的保留時間如圖1所示，分別為非那西丁1.29 min，安非他酮0.93 min，甲苯磺丁脲2.24 min，咪達(dá)唑侖1.10 min，地西泮2.49 min。該檢測方法對于4種探針?biāo)幍臋z測限均為1 ng/mL（信噪比＜3），在濃度范圍內(nèi)準(zhǔn)確度均小于10%，日內(nèi)和日間精密度相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）均小于10%，相對回收率為95%～105%。該法具有較高特異性，可用于同時測定4種探針?biāo)幍难獫{濃度。

圖1 大鼠血漿樣本中4種探針?biāo)幏悄俏鞫?、安非他酮、甲苯磺丁脲、咪達(dá)唑侖和內(nèi)標(biāo)地西泮檢測色譜圖

使用建立的方法測定不同時間點(diǎn)血漿樣本濃度，繪制藥時曲線，如圖2所示。與對照組相比，高劑量組大鼠連續(xù)給予枸杞多糖14 d后，甲苯磺丁脲的清除率（CLz/F）降低了27%，藥時曲線下面積[AUC(0-t)]和達(dá)峰濃度（Cmax）分別增加了50%和28%（P＜0.05），而低劑量枸杞多糖藥動學(xué)參數(shù)與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），表明只有高劑量枸杞多糖對CYP2C11活力具有顯著抑制作用（見表1）。與對照組相比，低劑量組大鼠咪達(dá)唑侖的CLz/F和表觀分布容積（Vz/F）分別降低了25%和35%，AUC(0-t)增加了38%；高劑量組大鼠咪達(dá)唑侖的CLz/F和Vz/F分別降低了34%和38%，AUC(0-t)、Tmax和Cmax分別增加了51%、50%和65%（P＜0.05），說明低高劑量枸杞多糖對CYP3A1活力均有抑制作用（見表2）。而給藥組和對照組大鼠的非那西丁和安非他酮的藥時曲線和藥動學(xué)參數(shù)比較未見差異（見表3-4）。

圖2 高低劑量組和對照組大鼠體內(nèi)4種探針?biāo)幏悄俏鞫?、安非他酮、甲苯磺丁脲和咪達(dá)唑侖代謝的藥時曲線圖

表1 低高劑量組和對照組甲苯磺丁脲藥動學(xué)參數(shù)（每組n=6，

表1 低高劑量組和對照組甲苯磺丁脲藥動學(xué)參數(shù)（每組n=6，

與對照組比：aP＜0.01

參數(shù) AUC0-t（ng·h/mL） t1/2z（h） Tmax（h） CLz/F（h） Vz/F（h） Cmax（ng/mL）對照組 85 817.35±9 604.16 5.98±1.00 0.88 0.011±0.001 0.097±0.018 7 630.62±607.06低劑量組 96 088.82±8 958.24 5.21±0.76 1.50 0.010±0.001 0.078±0.016 7 739.38±646.05高劑量組 128 644.62±9 524.45a 7.13±1.51 1.00 0.008±0.001a 0.076±0.011 9 764.50±458.82a

表2 低高劑量組和對照組咪達(dá)唑侖藥動學(xué)參數(shù)（每組n=6，

表2 低高劑量組和對照組咪達(dá)唑侖藥動學(xué)參數(shù)（每組n=6，

與對照組比：aP＜0.05，bP＜0.01

參數(shù) AUC0-t（ng·h/mL） t1/2z（h） Tmax（h） CLz/F（h） Vz/F（h） Cmax（ng/mL）對照組 338.90± 59.27 0.89±0.11 0.33 14.48±2.33 18.57±4.33 298.17± 39.73低劑量組 468.31±125.35a 0.78±0.15 0.50 10.86±2.74a 12.02±3.20a 378.77± 67.70高劑量組 510.45± 86.19b 0.81±0.38 0.50a 9.59±1.46b 11.44±6.60a 492.44±178.97b

表3 低高劑量組與對照組的非那西丁藥動學(xué)參數(shù)（每組n=6

表3 低高劑量組與對照組的非那西丁藥動學(xué)參數(shù)（每組n=6

參數(shù) AUC0-t（ng·h/mL） t1/2z（h） Tmax（h） CLz/F（h） Vz/F（h） Cmax（ng/mL）對照組 6 203.33±1 176.20 0.64±0.24 0.78 0.81±0.16 0.75±0.31 4 293.19±575.20低劑量組 5 493.81± 595.77 0.56±0.16 0.50 0.91±0.10 0.73±0.23 4 382.67±701.49高劑量組 5 884.34±1 023.57 0.56±0.22 0.50 0.85±0.14 0.69±0.26 4 620.89±410.56

2.2 枸杞多糖改變CYP450酶mRNA表達(dá) 各劑量組大鼠CYP450亞型表達(dá)水平如圖3所示，與對照組相比，低劑量組大鼠CYP2C11 mRNA表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），高劑量組CYP2C11 mRNA表達(dá)下調(diào)了56%；低高劑量組CYP3A1 mRNA表達(dá)分別下調(diào)了44%和68%，而低高劑量組CYP1A2和CYP2B1 mRNA水平與對照組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

表4 低高劑量組和對照組安非他酮藥動學(xué)參數(shù)（每組n=6，）

表4 低高劑量組和對照組安非他酮藥動學(xué)參數(shù)（每組n=6，）

參數(shù) AUC0-t（ng·h/mL） t1/2z（h） Tmax（h） CLz/F（h） Vz/F（h） Cmax（ng/mL）對照組 872.93±163.63 1.77±0.44 1.50 5.58±1.09 13.74±1.84 276.15±54.95低劑量組 889.49±232.39 1.40±0.29 1.50 5.81±1.97 11.43±2.95 290.15±68.83高劑量組 832.25± 96.19 1.68±0.28 1.25 5.80±0.77 13.82±1.25 273.95±15.98

圖3 高低劑量組與對照組大鼠CYP450亞型mRNA表達(dá)水平比較

3 討論

通過基因序列比對發(fā)現(xiàn)，大鼠的CYP450酶與人對應(yīng)的亞型mRNA序列具有70%以上同源性[10]，因此大鼠的CYP450變化對于臨床具有一定的參考意義。課題組前期建立了包括非那西丁、安非他酮、甲苯磺丁脲和咪達(dá)唑侖在內(nèi)的Cocktail探針法，通過這4個酶底物的代謝波動來推測相應(yīng)的CYP450酶活力變化[11-13]，課題組同時測定了枸杞多糖作用下CYP1A2、CYP2B1、CYP2C11、CYP3A1的基因表達(dá)，從酶活力和mRNA水平兩方面來評價枸杞多糖對CYP450的影響。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，枸杞多糖對大鼠CYP2C11表現(xiàn)出抑制作用，人體內(nèi)與之同源的亞型為CYP2C9。CYP2C9約占人體CYP450酶總量的20%左右，參與代謝約15%的臨床藥物，其中包括一些治療指數(shù)窄需要臨床監(jiān)測的藥物如華法林、苯妥英鈉等[14]，這類藥物如果體內(nèi)代謝發(fā)生變化，會導(dǎo)致半衰期延長或體內(nèi)暴露水平升高，從而發(fā)生嚴(yán)重的不良反應(yīng)。目前已有多篇案例[15-16]報道關(guān)于華法林治療期間患者服用枸杞茶或者枸杞汁導(dǎo)致凝血酶原時間國際標(biāo)準(zhǔn)化比值（INR）升高，排除其他生活飲食習(xí)慣的影響，提示枸杞茶（汁）是主要致病因素，并通過停止服用相關(guān)飲品來恢復(fù)治療。本研究發(fā)現(xiàn)枸杞多糖能抑制CYP2C11酶活力，推測可能對人CYP2C9酶活力發(fā)生抑制作用，進(jìn)而影響華法林在體內(nèi)的代謝，使華法林的體內(nèi)濃度升高，發(fā)生不良反應(yīng)。

實(shí)驗(yàn)同時發(fā)現(xiàn)，枸杞多糖能抑制CYP3A1酶活力和基因表達(dá)，人體內(nèi)同源的酶為CYP3A4。CYP3A4是人體內(nèi)表達(dá)最豐富的CYP450，占酶蛋白總含量的30%～40%，約50%的臨床藥物經(jīng)由CYP450代謝，如質(zhì)子泵抑制劑、核苷類抗病毒藥、免疫抑制劑、他汀類降脂藥、苯二氮卓類鎮(zhèn)靜催眠藥、二氫吡啶類鈣拮抗劑等[17]。當(dāng)長期服用枸杞多糖的特定人群同時服用此類藥物時，需注意可能會抑制它們在體內(nèi)的代謝，導(dǎo)致體內(nèi)暴露水平升高，進(jìn)而發(fā)生不良反應(yīng)。

綜上所述，枸杞多糖能抑制大鼠CYP2C11和CYP3A1酶活力，但不影響CYP1A2和CYP2B1酶活力。同時，枸杞多糖對CYP450活力和mRNA表達(dá)的抑制作用一致，表明枸杞多糖可能是通過干預(yù)基因表達(dá)來實(shí)現(xiàn)對酶活力的調(diào)控，但具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。