逯雯潔，喬亞玲，海平

腦得生片是由三七、川芎、紅花、葛根、山楂五味飲片組成的中藥復(fù)方制劑，具活血化瘀、通經(jīng)活絡(luò)之功效。用于淤血阻絡(luò)導(dǎo)致的眩暈、中風(fēng)，肢體不用、言語(yǔ)不利及頭暈?zāi)垦５劝Y狀；腦動(dòng)脈硬化、缺血性中風(fēng)及腦出血后遺癥見上述癥候者。處方中紅花藥材被檢出染色劑已有許多的報(bào)道［1］，檸檬黃為其常用的染色劑之一。檸檬黃又名酒石黃、酸性淡黃、肼黃等?；瘜W(xué)名稱為1-（4-磺酸苯基）-4-（4-磺酸苯基偶氮）-5-吡唑啉酮-3-羧酸三鈉鹽，為水溶性合成色素。由于部分企業(yè)紅花原藥材的采購(gòu)、質(zhì)量控制環(huán)節(jié)相對(duì)薄弱，未對(duì)紅花染色情況加以關(guān)注，造成腦得生片中含有微量檸檬黃。本品為中藥復(fù)方制劑，其他藥味對(duì)檢測(cè)存在一定的干擾，因此有必要對(duì)腦得生片中非法染色物檢測(cè)方法進(jìn)行系統(tǒng)的研究，從而更好地控制藥品內(nèi)在質(zhì)量。本研究自2017 年10 月至

2018年10月在查閱相關(guān)文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上［2-5］，建立了腦得生片中檸檬黃的高效液相色譜法全波長(zhǎng)掃描紫外檢測(cè)（HPLC_DAD）方法，并采用液相-質(zhì)譜聯(lián)用（LCMS）法對(duì)陽(yáng)性結(jié)果加以確認(rèn)，為打擊腦得生片中非法染色提供技術(shù)依據(jù)，保證人民用藥安全有效。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Sartorius BSA 224S-CW 電子天平（德國(guó)Sartorius公司）、KQ3200DE型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）、Agilent 1260 型高效液相色譜儀（二極管陣列檢測(cè)器，美國(guó)安捷倫公司）、Waters 2695 型高效液相色譜儀（二極管陳列檢測(cè)器，美國(guó)沃特世公司）AB SCIEX Triple Quad 5500 液質(zhì)聯(lián)用色譜儀（三重四級(jí)桿，美國(guó)AB公司）。

1.2 試劑與藥品 檸檬黃對(duì)照試劑（批號(hào)30117，純度90.0%購(gòu)自德國(guó)Dr.公司）；乙腈、甲醇為色譜純，水為超純水（Milli-Q），其他試劑均為分析純。

腦 得 生 片（A 廠，批 號(hào)160102；B 廠，批 號(hào)160701；C 廠，批號(hào)20170101；D 廠，批號(hào)160201；E廠，批號(hào)160301；F 廠，批號(hào)20160403；G 廠，批號(hào)170329；H 廠，批號(hào)151101；I 廠，批號(hào)20170301；J廠，批號(hào)20150201；K 廠，批號(hào)20151001；L 廠，批號(hào)160101；M廠，批號(hào)150202、150101、160101；N廠，批號(hào)160102；O廠，批號(hào)C1610012）。

2 方法和結(jié)果

2.1 色譜條件 Phenomenex Luna C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱；流動(dòng)相A 為乙腈；流動(dòng)相B 為0.05 mol/L 醋酸銨溶液；梯度洗脫（0～45 min，5%A→45%A）；DAD 檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)：432 nm；柱溫30 ℃；流速1.0 mL/min；進(jìn)樣量10μL。理論板數(shù)按檸檬黃峰計(jì)算應(yīng)不低于3 000。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照試劑溶液 稱取檸檬黃對(duì)照試劑適量，加70%乙醇制成25μg/mL的對(duì)照試劑溶液，即得。

2.2.2 供試品溶液 取腦得生片20 片，除去包衣，稱定重量，研細(xì)，取約5 g，精密稱定，精密加入70%乙醇10 mL，稱定重量，超聲處理20 min，放冷，再稱定重量，用70%乙醇補(bǔ)足減失的重量，濾過，即得。

2.2.3 陰性對(duì)照溶液的制備 取檢測(cè)未添加檸檬黃的紅花和其他原料藥材，按處方制得陰性樣品。稱取5 g，同供試品溶液制備法，制成陰性溶液。

2.3 專屬性實(shí)驗(yàn) 精密吸取對(duì)照試劑溶液與供試品溶液各10μL，注入液相色譜儀。結(jié)果陽(yáng)性樣品呈現(xiàn)與對(duì)照試劑保留時(shí)間相一致的色譜峰，陰性樣品在同一保留時(shí)間無(wú)相應(yīng)色譜峰出現(xiàn)，見圖1。陽(yáng)性樣品中，與檸檬黃對(duì)照試劑保留時(shí)間相一致色譜峰的紫外吸收光譜與檸檬黃對(duì)照試劑一致，見圖2。

2.3.1 質(zhì)譜確認(rèn)

2.3.1.1 質(zhì)譜條件 色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18（1.8 μm，50 mm×2.1 mm）；流動(dòng)相：乙腈（A）一0.02 mol/L 醋酸銨溶液（B），梯度洗脫（0～20 min，2%A～45%A）；流速：0.3 mL/min；柱溫：30 ℃。質(zhì)譜檢測(cè)參數(shù)：電噴霧負(fù)離子模式（ESI-），檢測(cè)方式：一級(jí)質(zhì)譜全掃描、多反應(yīng)檢測(cè)（MRM）方式；去簇電壓100 V，入口電壓10 V，碰撞能量16～31 V，源溫度450 ℃，碰撞室出口電壓3～12 V。

2.3.1.2 檢測(cè)結(jié)果 檸檬黃屬吡唑啉酮類合成色素，檸檬黃在環(huán)上有羧基，較小的碰撞能量就能脫羧釋出CO2，接著同時(shí)發(fā)生吡唑啉酮環(huán)的開裂（C-C鍵，N-C鍵）和N-C鍵環(huán)合，生成大量離子。

圖1 HPLC色譜圖：A為對(duì)照試劑；B為陽(yáng)性樣品；C為陰性樣品

圖2 光譜圖：A為對(duì)照試劑，B為陽(yáng)性樣品

檸檬黃精確質(zhì)量為533.950 4，在負(fù)離子模式丟失特點(diǎn)為-3Na+2H，形成m/z 為467 的分子離子峰。以467m/z為母離子進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜分析，選取豐度較強(qiáng)，干擾較小的兩對(duì)子離子，進(jìn)行多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）模式檢測(cè)。在檸檬黃染色樣品色譜中，相應(yīng)的色譜峰具有與檸檬黃相同的質(zhì)譜特征。見圖3、圖4。

圖3 檸檬黃對(duì)照試劑的選擇離子色譜圖：A為m/z 198.1，B為m/z 171.0

圖4 陽(yáng)性樣品的選擇離子色譜圖：A為m/z 198.1，B為m/z 171.0

2.4 精密度 精密吸取檸檬黃對(duì)照試劑溶液（濃度約為25μg/mL），連續(xù)進(jìn)樣5 次，進(jìn)樣量10μL，測(cè)得檸檬黃保留時(shí)間及峰面積，保留時(shí)間RSD為0.20%，峰面積RSD為0.30%。結(jié)果表明精密度良好。

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，室溫下放置，在0、1、2、4、6、12、24 h分別進(jìn)樣10μL進(jìn)行分析，測(cè)定峰面積積分值，檸檬黃峰面積積分值的RSD為0.98%。結(jié)果表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好

2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，精密稱取6份，按上述方法制成供試品溶液，測(cè)定檸檬黃峰面積，結(jié)果檸檬黃色譜峰重現(xiàn)性良好，見圖5。

圖5 腦得生片HPLC色譜圖

2.7 不同儀器及色譜柱的考察 由于不同生產(chǎn)廠家的高效液相色譜儀和色譜柱存在性能上的差異，為考察方法的可行性及通用性，對(duì)樣品還進(jìn)行了以下耐用性試驗(yàn)，①采用不同廠家生產(chǎn)的色譜柱。②在不同的儀器上測(cè)定。結(jié)果表明耐用性較好。見圖6、圖7，為用Waters 2695 型高效液相色譜儀，Boston Boscherom ODS C18（5μm，250 mm×4.6mm）色譜柱所得色譜圖。

圖6 對(duì)照試劑HPLC色譜圖：Waters2695，Boston Boscherom ODS C18

2.8 檢測(cè)限 取檸檬黃對(duì)照試劑一定量配制一定濃度的對(duì)照溶液，按上述液相色譜條件，進(jìn)樣測(cè)定，以信噪比法（S/N＝3）測(cè)得檸檬黃的檢出限為0.002μg。

2.9 樣品測(cè)定 分別對(duì)上述15家企業(yè)17批腦得生片樣品進(jìn)行了檢測(cè)，判定3 個(gè)生產(chǎn)企業(yè)的3 個(gè)批號(hào)腦得生片檢出有摻偽染色現(xiàn)象：B 廠，批號(hào)160701；H 廠，批號(hào)151101；L 廠，批號(hào)160101。染色物為檸檬黃，且符合上述方法中視為陽(yáng)性檢出的規(guī)定。

3 討論

圖7 腦得生片HPLC色譜圖：Waters2695，Boston Boscherom ODS C18

紅花染色目的主要為，通過染色增重、摻偽；染色樣品以次充好等。本研究重點(diǎn)考察項(xiàng)目紅花藥材為加水煎煮兩次（共2.5 h）后取清膏入藥。試驗(yàn)中模擬上述生產(chǎn)工藝制成檸檬黃陽(yáng)性添加模擬制劑進(jìn)行了研究，旨在考察染色劑的熱穩(wěn)定性、配伍穩(wěn)定性等因素。結(jié)果表明：檸檬黃染色劑在生產(chǎn)工藝條件下穩(wěn)定性良好。

檸檬黃作為一類常用染色劑，并非天然產(chǎn)物，非法染色系人為作假行為。采用本研究建立的方法，對(duì)腦得生片樣品進(jìn)行了篩查。陽(yáng)性樣品的檢出，說明中成藥還是存在一定的被化工染料污染情況。針對(duì)這種情況后續(xù)還需開展進(jìn)一步的研究，以保證中成藥的安全有效。