熊大維 顧斌濤 劉蘭 黃筱萍

摘要?從采摘后貯存自然發(fā)病的贛南臍橙中分離出4種病原真菌，根據(jù)菌株形態(tài)學(xué)觀察和rDNA-ITS序列分析進(jìn)行鑒定，這4種病原真菌分別為意大利青霉（Penicillium?italicum）、指狀青霉（Penicillium?digitatum）、柑橘鏈格孢（Alternaria?citri）和芽枝狀枝孢（Cladosporium?cladosporioides）。生物保鮮劑2-苯乙醇（2-PE）可有效地抑制這4種病原真菌的孢子萌發(fā)和菌絲生長(zhǎng)，但對(duì)不同致腐菌抑菌效果差異顯著（P<0.05）。2-PE對(duì)芽枝狀枝孢霉、指狀青霉菌、柑橘鏈格孢和意大利青霉菌菌絲生長(zhǎng)的最小抑菌濃度分別為1.4、1.8、2.2和2.4?g/L。

關(guān)鍵詞?臍橙病原菌;形態(tài)學(xué)觀察;分子鑒定;2-苯乙醇;抑菌

中圖分類號(hào)?TS255.3文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼?A文章編號(hào)?0517-6611（2020）07-0186-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.07.053

Isolation?and?Identification?of?Citrus?Pathogens?from?Navel?Orange?in?Southern?Jiangxi?Province?and?Sensitivity?Analysis?to?2Phenylethanol?Alcohol

XIONG?Dawei，?GU?Bintao，?LIU?Lan?et?al

（Institution?of?Microbiology，?Jiangxi?Academy?of?Sciences，?Nanchang，?Jiangxi?330096）

Abstract?Four?citrus?pathogens?were?isolated?from?rotten?orange?of?Southern?Jiangxi?Province?after?harvesting.?According?to?the?observation?of?the?morphological?characteristics?of?fungi?and?the?analysis?of?rDNAITS?sequence，?the?four?citrus?pathogens?were?identified?as?Penicillium?italicum，?Penicillium?digitatum，?Alternaria?citri?and?Cladosporium?cladosporioides.?The?biopreservative?2phenylethyl?alcohol?can?effectively?inhibit?the?spore?germination?and?hyphae?growth?of?the?four?citrus?pathogens，?but?the?antibacterial?effects?of?different?saprophytic?fungi?were?significantly?different?（P<0.05）.?The?minimum?inhibitory?concentrations?for?the?hyphae?growth?of?C.?cladosporioides，?P.?digitatum，?A.?citri?and?P.?italicum?were?1.4，?1.8，?2.2?and?2.4?g/L，?respectively.

Key?words?Citrus?pathogens;Morphological?observation;Molecular?identification;2Phenylethanol?alcohol;Antibacterial

基金項(xiàng)目?江西省重點(diǎn)研發(fā)項(xiàng)目（S2018ZPYFE1016）;江西省科學(xué)院重大研究專項(xiàng)（2018-YZD1-03）。

作者簡(jiǎn)介?熊大維（1975—），男，江西靖安人，助理研究員，從事微生物學(xué)研究。通信作者，研究員，碩士，從事生物工程及生物活性產(chǎn)物的制備和應(yīng)用研究。

收稿日期?2019-10-09;修回日期?2019-10-28

近年來，我國(guó)柑橘產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅猛，年產(chǎn)量超過2?900萬t，由于成熟度相對(duì)集中，其貯藏加工業(yè)的發(fā)展遠(yuǎn)遠(yuǎn)滯后于種植業(yè)，每年鮮果在采摘后貯藏、運(yùn)輸和銷售環(huán)節(jié)的損失巨大，果品腐爛率為10%～40%[1-2]，造成重大的經(jīng)濟(jì)損失。引起柑橘腐爛的病害有20多種，其中約90%的柑橘采后腐爛是由意大利青霉引起的青霉病，指狀青霉引起的綠霉病和鏈格孢霉引起的黑腐病[3-7]。目前主要采用化學(xué)防腐劑進(jìn)行防腐保鮮，由于存在病原菌對(duì)化學(xué)制劑易產(chǎn)生抗藥性，且對(duì)人體健康具有一定危害和造成環(huán)境污染，已被陸續(xù)禁止使用[8-9]。

2-苯乙醇（2-PE）是一種具有玫瑰氣味的芳香醇，廣泛存在于自然界中，具有廣泛的抗菌活性，可抑制大腸桿菌等G-菌和枯草芽孢、金黃色釀膿葡萄球菌等G+菌的生長(zhǎng)，對(duì)酵母菌、青霉菌等真菌亦具有顯著的抑制作用[10-12]。其在食品防腐保鮮上的研究也已經(jīng)開展，劉普[13]研究表明生防菌檸檬形克勒克酵母菌對(duì)柑橘采后青、綠霉菌具有很好的防治效果，分離獲得對(duì)抑制真菌的有效成分為該菌產(chǎn)生的2-PE。方靜凡[14]發(fā)現(xiàn)2-PE對(duì)導(dǎo)致水果（如柑橘、蘋果、葡萄等）腐敗的許多真菌具有良好的防治效果，并對(duì)其最低抑菌濃度和抑菌機(jī)理進(jìn)行了初步研究;采用產(chǎn)2-PE的酵母菌液涂抹，在果品上形成菌膜以達(dá)到生防效果。陳利軍等[15]發(fā)現(xiàn)2-PE對(duì)植物病原真菌如草莓灰霉病菌、白菜黑斑病菌等具有顯著的抑菌效果。

該研究從自然腐爛的臍橙中分離獲得4種致腐真菌，通過形態(tài)學(xué)觀察和分子學(xué)鑒定，確定了其種、屬。針對(duì)這些致腐真菌，采用生物法轉(zhuǎn)化合成的2-PE進(jìn)行了抑菌試驗(yàn)，確定了2-PE對(duì)不同真菌的孢子萌發(fā)最小抑菌濃度（MIC）和菌絲生長(zhǎng)最小抑菌濃度。由于2-PE具有較好的水溶性和穩(wěn)定性，安全無毒，對(duì)真菌有較好的抑制作用，可開發(fā)為一種新型的生物防腐劑用于果蔬、食品的保鮮，為今后的植物病原菌的抑菌試驗(yàn)和抑菌機(jī)制研究提供基礎(chǔ)。

1?材料與方法

1.1?材料與儀器

臍橙摘自贛州（信豐縣和安遠(yuǎn)縣）不同果園，置通風(fēng)處保存。2-PE粗提液，是由本實(shí)驗(yàn)室生物轉(zhuǎn)化液經(jīng)乙醇抽提濃縮而成的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為80%～90%粗制品[16];馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato?dextrose?agar，PDA）培養(yǎng)基，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

BX53型顯微鏡（日本Olympus公司）;Prachfum?224-1CN分析天平（德國(guó)Sartorius公司）;L204電子天平（梅特勒-托利多儀器（上海）股份有限公司）;MJX-250B-Z霉菌培養(yǎng)箱（上海博迅醫(yī)療生物儀器有限公司）;CD-AX數(shù)顯式游標(biāo)卡尺（世達(dá)工具（中國(guó)）有限公司）;SW-CJ-ID型雙人凈化工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備有限公司）;LDZX-50KBS手輪型立式蒸汽滅菌鍋（上海申安儀表有限公司）。

1.2?方法

1.2.1?菌種分離純化與鑒定。選擇具有典型發(fā)病癥狀的臍橙，用75%乙醇清洗患處表面，再用無菌刀片切取病患交界處5?mm×5?mm的組織，用2%NaClO溶液表面消毒，無菌水沖洗3次，接入PDA平板培養(yǎng)基上，于（28±0.5）℃倒置培養(yǎng)，待菌絲長(zhǎng)出后，用無菌接種針挑取前緣菌絲植入另一培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)，重復(fù)上述操作3次即可獲得純化菌株。

1.2.2?真菌種屬鑒定。

1.2.2.1?病原真菌形態(tài)學(xué)鑒定。通過觀察病原體菌落特征和培養(yǎng)特佂，包括菌落大小、顏色、邊緣、滲出物等，在顯微鏡下觀察菌絲生長(zhǎng)情況、孢子形態(tài)、產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)及有無橫隔的特征，進(jìn)而進(jìn)行顯微形態(tài)分類鑒定。參照真菌鑒定手冊(cè)進(jìn)行病原菌的初步鑒定[17]。

1.2.2.2?病原真菌的rDNA-ITS序列分析。

采用rDNA-ITS分子鑒定法對(duì)病原菌株進(jìn)行分析。以不同病原菌的DNA作為模板，用通用引物擴(kuò)增出約550?bp的rDNA-ITS序列，PCR反應(yīng)條件：預(yù)變性94?℃?3?min;變性95?℃?1?min，退火54?℃?40?s，延伸72?℃?40?s，35個(gè)循環(huán);終延伸72?℃?10?min，保溫4?℃?60?min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，于上海生物工程有限公司完成測(cè)序。將測(cè)序獲得rDNA-ITS序列在GenBank核酸數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行Blast搜索比對(duì)。

1.2.3?2-PE對(duì)病原真菌孢子萌發(fā)率的影響。將4種病原菌株分別于PDA斜面培養(yǎng)基中28?℃培養(yǎng)6?d，分別加入10?mL無菌水，用玻璃棒洗下孢子，菌液再分別倒入20?mL注射器中，經(jīng)4層無菌紗布過濾，收集孢子液，于4?℃冰箱貯存?zhèn)溆?。用血球?jì)數(shù)器計(jì)數(shù)孢子濃度，稀釋孢子液為10-4和10-5，涂布于含2-PE分別為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2?g/L的培養(yǎng)基中，以不加2-PE的平皿為對(duì)照，每個(gè)梯度涂布3皿，于28?℃培養(yǎng)3～6?d，計(jì)算孢子萌發(fā)率。

孢子萌發(fā)率（%）=處理平皿中菌落數(shù)對(duì)照平皿中菌落數(shù)×100（1）

1.2.4?菌絲生長(zhǎng)抑制率的測(cè)定（采用菌絲生長(zhǎng)速率測(cè)定法）。將4種病原菌孢子液分別涂布于PDA平皿中，于28?℃培養(yǎng)6～7?d，用打孔器在培養(yǎng)基上打孔，取生長(zhǎng)一致的菌苔，備用。配制含2-PE濃度為0.4、0.8、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0、2.2、2.4?g/L的培養(yǎng)基，用量杯量取等量體積倒入平皿中，用￠5?mm打孔器切取生長(zhǎng)一致的病原菌菌塊，移植于含藥劑的平皿中，每塊平皿植入3塊菌苔做平行試驗(yàn)，另設(shè)加無菌水的PDA培養(yǎng)基平板作為對(duì)照。置于28?℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，用游標(biāo)卡尺測(cè)量菌落直徑，取?120?h的菌落平均值計(jì)算菌絲生長(zhǎng)抑制率，測(cè)定2-PE對(duì)病原菌的抑菌率[18]。

菌絲生長(zhǎng)抑制率（%）=對(duì)照菌落直徑-處理菌落直徑對(duì)照菌落直徑-菌餅直徑×100（2）

2?結(jié)果與分析

2.1?病原真菌的形態(tài)學(xué)鑒定

在真菌識(shí)別中，有形態(tài)學(xué)識(shí)別，如菌落形態(tài)、顏色、在不同時(shí)間的生長(zhǎng)狀態(tài)、菌絲及孢子的形態(tài)及大小等。從自然腐爛的臍橙中分離出4種真菌，分別編號(hào)為FZ-1、FZ-2、FZ-3和FZ-4，菌落形態(tài)及孢子生長(zhǎng)描述如下。

2.1.1?FZ-1菌株。菌株在PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)2?d后，菌落表面平整呈白色，少許菌落中間略微凸起并附有青綠色孢子，菌落稀疏蓬松;培養(yǎng)3?d后，菌落表面仍平整，表面呈青綠色，邊緣呈白色，表面附有青綠色孢子，菌落稀疏蓬松。菌絲體由分枝的、分隔的、光滑的、透明至半透明的菌絲構(gòu)成，菌絲2.7～6.0?μm寬。分生孢子梗與菌絲異形或同形，單菌絲構(gòu)成，透明至半透明，光滑，薄壁，有分隔，分枝或不分枝，圓柱形，3.3～9.0?μm寬。產(chǎn)孢細(xì)胞單點(diǎn)芽植型產(chǎn)孢，（14.0～26.0）?μm×（3.0～4.2）μm，輪生，每輪2～4個(gè)倒棒狀或近圓柱形的產(chǎn)孢細(xì)胞，頂部變細(xì)，中間略膨大，基部平截，透明，頂生或側(cè)生，光滑。分生孢子全壁芽植型，單生，孢子呈鏈狀向上生長(zhǎng)，質(zhì)地干，未成熟時(shí)透明，成熟后半透明至淡灰黑褐色，光滑，壁薄，基部平截，頂部圓滑，無隔膜，部分近球形至球形，橢球形或倒卵形（5.0～12.5）μm×（4.2～10.1）μm（=7.8?μm×6.0?μm，n=45）;部分近圓柱形（8.4～24.0）?μm×?（2.8～5.5）μm（=15.0?μm×4.3?μm，n=35）;分生孢子裂解式脫落。還有一部分非常小的分生孢子，近球形或橢球形至球形（3.2～6.0）μm×（2.8～4.3）μm（=?4.2?μm×3.3?μm，n=45）。圖1為FZ-1的菌落形態(tài)及菌絲和孢子生長(zhǎng)狀態(tài)。

2.1.2?FZ-2菌株。菌株在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)2?d后，菌落表面凸起呈灰色，邊緣菌絲呈白色，表面附有灰色的孢子，菌落濃密緊湊;培養(yǎng)3?d后，菌落表面仍凸起且顏色加深，邊緣菌絲呈白色，表面附著大量的孢子，菌落濃密緊湊。菌絲體由分枝的、分隔的、光滑的、透明至淡灰褐色的菌絲構(gòu)成，菌絲2～4?μm寬。分生孢子梗與菌絲異形或同形，單菌絲構(gòu)成，半透明或淺褐色至中褐色，光滑，薄壁，有分隔，分枝或不分枝，圓柱形至近杯狀，3～4?μm寬。產(chǎn)孢細(xì)胞多點(diǎn)芽植型產(chǎn)孢，半透明至淺褐色，與分生孢子梗整合，光滑，（9.0～28.0）?μm×（2.5～5.0）μm（=?12.7?μm×?3.7?μm，n=20），內(nèi)部有細(xì)小油滴。分生孢子全壁芽植型，多生，孢子呈鏈狀向上生長(zhǎng)，質(zhì)地干，透明至淺褐色，近球形至球形，橢球狀到近紡錘形或倒卵形，部分近圓柱形，基部和頂部平截，最頂端孢子基部平截，頂部圓滑，0-1（-2）隔，光滑，壁薄，（3.8～11.0）×（2.6～4.5）μm（=?6.8?μm×3.4?μm，n=50）;分生孢子裂解式脫落（圖2）。

2.1.3?FZ-3菌株。菌株在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)2?d后，菌落濃密不緊湊，表面灰白色至淺褐色，表面菌絲清晰可見，菌絲較分散，菌落中央無凸起，邊緣菌絲呈白色;培養(yǎng)3?d后，菌落濃密不緊湊，顏色呈灰白色至深褐色，培養(yǎng)基反面深褐色至黑色。菌絲體堆在一起褐色;菌絲分枝，具隔膜，半透明至深褐色，表面光滑，壁薄，寬2.5～6.4?μm（3.8?μm，n=40）。分生孢子梗寬2.2～5.3?μm（3.9?μm，n=25），頂端產(chǎn)孢，表面光滑，褐色至中褐色。產(chǎn)孢細(xì)胞圓柱形，淺褐色至褐色，在分生孢子梗的頂端。分生孢子單生，頂生，（15.0～36.0）?μm×（8.0～15.2）μm（23.6?μm×11.3?μm，n=40），基部平截2.4～4.5?μm（3.5?μm，n=40），隔膜網(wǎng)格狀，具橫隔膜和縱隔膜，橫膈膜較多1～6個(gè)隔膜，縱隔膜一般1個(gè)，分孢子呈卵形、紡錘形，棍棒狀、球形至橢球形，淺褐色至中褐色，表面光滑，壁薄（圖3）。

2.1.4

FZ-4?菌株。菌株在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)2?d后，菌落濃密緊湊，表面灰白色，菌落中央凸起呈灰白色，邊緣菌絲呈白色;培養(yǎng)3?d后，菌落表面呈灰白色至淺青色，菌落濃密，表面可見灰白色孢子，培養(yǎng)基反面棕黃色。菌絲分枝，具隔膜，透明至淺色，表面光滑，壁薄。分生孢子梗寬2.6～4.5?μm（3.5?μm，n=20），表面光滑，透明至淺色，產(chǎn)孢細(xì)胞頂端集中呈掃帚狀。產(chǎn)孢細(xì)胞頂生，燒瓶形瓶梗，（8.0～25.0）μm×（2.0～3.0）μm（16.1?μm×?2.6?μm，n=20），透明，壁薄，基部寬頂部窄。分生孢子頂生，數(shù)量非常多，散射狀，（2.8～7.6）μm×（2.05～4.8）μm（4.55?μm×?2.88?μm，n=70），無隔膜，球形、橢球形至長(zhǎng)橢球形，淺褐色至透明，表面光滑，壁?。▓D4）。

2.2?病原真菌的分子學(xué)鑒定

利用18S和28S的上下游引物序列，得到以上4種病原菌菌株的序列結(jié)果（表1），與NCBI?Blast?上的已知序列進(jìn)行比對(duì)，以確定病原真菌種或亞種。

由表1可知，利用rDNA-ITS鑒定4種臍橙病原真菌分別如下：FZ-1為指狀青霉（Penicillium?digitatum），F(xiàn)Z-2為芽枝狀枝孢霉（Cladosporium?cladosporioides），F(xiàn)Z-3為柑橘鏈格孢（Alternaria?citri），F(xiàn)Z-4為意大利青霉（Penicillium?italicum），與各自源物種的同源性均達(dá)100%。

2.3?不同質(zhì)量濃度的2-PE對(duì)4種病原真菌孢子萌發(fā)率的影響

2-PE對(duì)細(xì)胞具有一定的毒性，其抑菌作用主要是通過增加細(xì)胞膜的通透性而擾亂跨膜質(zhì)子電勢(shì)，以及作為大分子合成的抑制劑抑制細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)和RNA的合成。不同的微生物對(duì)2-PE的耐受性不同，通常質(zhì)量濃度為0～2?g/L的2-PE可抑制大部分微生物生長(zhǎng)，當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)4?g/L可完全抑制酵母菌生長(zhǎng)[19]。由表2可知，2-PE對(duì)4種病原菌孢子萌發(fā)均有顯著（P<0.05）的抑制效果，在濃度為0.6?g/L時(shí)可全部抑制柑橘鏈格孢和芽枝狀枝孢霉的孢子萌發(fā)，對(duì)指狀青霉和意大利青霉的最低孢子萌發(fā)抑制濃度分別為0.8和1.2?g/L，2-PE對(duì)意大利青霉的孢子萌發(fā)率抑制效果較弱。

2.4?不同質(zhì)量濃度的2-PE對(duì)4種病原真菌的抑菌效果

2-PE對(duì)柑橘致腐菌均有很好的抑菌作用（表3）。在一定質(zhì)量濃度下，2-PE對(duì)芽枝狀枝孢霉的抑制效果最好，其次為指狀青霉和柑橘鏈格孢，對(duì)意大利青霉的抑制效果相對(duì)較弱。其最小抑菌濃度（MIC）分別為1.4、1.8、2.2、2.4?g/L，即2-PE濃度達(dá)2.4?g/L時(shí)，可完全抑制4種病原菌菌絲的生長(zhǎng)。方靜凡[14]采用2-PE對(duì)多種果實(shí)病原真菌的抑菌譜進(jìn)行檢測(cè)，2-PE濃度為0.2%～0.4%（V/V）時(shí)可完全抑制柑橘綠霉菌、黑腐菌、炭疽菌，蘋果青霉菌和灰霉菌等多種致腐真菌的生長(zhǎng)，對(duì)意大利青霉菌B3的最小抑菌濃度MIC為0.25%（V/V）。

3?結(jié)論

從不同地區(qū)自然腐爛的臍橙中分離純化出4種病原真菌，通過觀察菌落形態(tài)，菌絲生長(zhǎng)，分生孢子形狀、大小及分生孢子梗形態(tài)等對(duì)其進(jìn)行鑒定，由于真菌生長(zhǎng)條件改變，菌絲的生長(zhǎng)形態(tài)會(huì)有改變、厚垣孢子難形成和觀察，分生孢子在形態(tài)學(xué)上差異小，對(duì)菌絲、孢子的描述困難，較難區(qū)分多種菌株之間的差異。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，rDNA-ITS被廣泛應(yīng)用于果蔬類采后病原菌的分離和鑒定[20-22]。通過18S?rDNA測(cè)序以及在GenBank核酸數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行Blast比對(duì)，結(jié)果表明這4種柑橘致腐菌分別為意大利青霉、指狀青霉、柑橘鏈格孢和芽枝狀枝孢霉。其中意大利青霉、指狀青霉和柑橘連格孢為引起柑橘采后腐爛的主要病原真菌。利用分子學(xué)技術(shù)進(jìn)行輔助鑒定，可以鑒定出親緣關(guān)系較近的種、屬。

2-苯乙醇對(duì)柑橘致腐菌的孢子萌發(fā)和菌絲生長(zhǎng)均有較強(qiáng)的抑制效果，2-PE可在較低的質(zhì)量濃度下完全抑制真菌孢子萌發(fā)，相較于酵母菌和真菌菌絲，真菌孢子對(duì)2-PE具有更高的敏感性，可能是孢子在萌發(fā)過程中蛋白質(zhì)和RNA的合成更易受到2-PE的抑制。在相同的質(zhì)量濃度下，2-PE抑制4種病原真菌孢子萌發(fā)的強(qiáng)弱順序依次為芽枝狀枝孢、柑橘鏈格孢、指狀青霉、意大利青霉，濃度為1.2?g/L時(shí)可完全抑制病原菌孢子的萌發(fā)。而在相同的質(zhì)量濃度下，2-PE對(duì)芽枝狀枝孢霉菌生長(zhǎng)的抑菌效果最強(qiáng)，其次為指狀青霉、柑橘鏈格孢，對(duì)意大利青霉抑菌較弱，在濃度為2.4?g/L時(shí)可完全抑制4種病原真菌的生長(zhǎng)。該研究從采后腐爛的贛南臍橙中分離出主要的致腐真菌，并采用生物轉(zhuǎn)化的2-PE進(jìn)行了抑菌效果評(píng)價(jià)，為進(jìn)一步開發(fā)新型果蔬保鮮生物保鮮劑2-PE奠定了基礎(chǔ)。

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