?？? 楊絨娟 李召斌 張文君 趙永峰 晏磊 周德剛

摘要?[目的]考察阿莫西林可溶性粉在雞蛋中的殘留消除規(guī)律，確定其休藥期，防止其在臨床上的不合理使用。[方法]選取2組健康成年已開產蛋雞分別灌服不同廠家的阿莫西林，劑量均為100?mg/kg體重，連續(xù)用藥5?d。給藥期間至給藥后14?d進行取樣，每日每組取雞蛋15枚，使用ELISA試劑盒進行阿莫西林殘留檢測，并用WT1.4軟件計算阿莫西林的休藥期。[結果]2組均在停藥后第1天藥物濃度達到最高值，阿莫西林在雞蛋中的休藥期分別為12.74和12.72?d。[結論]阿莫西林在雞蛋中的殘留時間較長，且不同廠家的阿莫西林在雞蛋中的休藥期無差異。

關鍵詞?阿莫西林;雞蛋;藥物殘留;休藥期

中圖分類號?S859.84文獻標識碼?A文章編號?0517-6611（2020）07-0110-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.07.032

Study?on?the?Residual?and?Elimination?Laws??of?Amoxicillin?Residues?in?Eggs

SANG?Kana，?YANG?Rongjuan，?LI?Zhaobin?et?al

（Luoyang?Huizhong?Animal?Medicine?Co.，Ltd.，National?Research?Center?for?Veterinary?Medicine，Luoyang，Henan?471003）

Abstract?[Objective]?To?investigate?the?rule?of?residual?elimination?of?amoxicillin?in?eggs，?determine?the?withdrawal?period?and?prevent?its?unreasonable?use?in?clinic.?[Method]?Two?groups?of?healthy?adult?laying?hens?were?fed?with?amoxicillin?from?different?manufacturers?at?a?dose?of?100?mg/kg?body?weight?for?5?days.?Samples?were?taken?during?the?administration?period?to?14?days?after?the?administration，?15?eggs?were?taken?from?each?group?daily.?ELISA?kit?was?used?to?detect?the?amoxicillin?residues?and?WT1.4?software?to?calculate?the?withdrawal?period.?[Result]?Drug?concentration?in?the?both?groups?reached?the?highest?values?on?the?first?day?after?discontinuation.?The?withdrawal?period?of?amoxicillin?in?eggs?in?two?groups?was?12.74?and?12.72?d?respectively.[Conclusion]?Amoxicillin?has?a?longer?residual?time?in?eggs，?and?there?was?no?significant?difference?in?the?drug?withdrawal?period?between?the?different?manufacturers?of?amoxicillin?in?eggs.

Key?words?Amoxicillin;Eggs;Drug?residue;Withdrawal?period

作者簡介??？龋?990—），女，河南駐馬店人，獸醫(yī)師，碩士，從事獸醫(yī)藥理毒理研究、獸藥殘留檢測等工作。

通信作者，高級獸醫(yī)師，碩士，從事新獸藥研發(fā)與開發(fā)工作。

收稿日期?2019-10-08;修回日期?2019-10-25

阿莫西林（Amoxicillin）又名羥氨芐青霉素，是一種最常用的青霉素類廣譜β-內酰胺類抗生素，具有殺菌能力強、口服吸收好、血藥濃度高且不受食物影響的特點[1]，在醫(yī)學和獸醫(yī)臨床上應用廣泛。在實際養(yǎng)殖臨床用藥中的不規(guī)范使用，導致阿莫西林在動物各組織中的殘留，一方面引起細菌耐藥菌株的產生，另一方面攝入青霉素殘留超標的動物可食性組織，經胃腸道吸收容易造成過敏反應[2]和其他對身體的潛在危害。

阿莫西林殘留量檢測是當前中國、歐盟和北美等國家對動物性食品的必檢項目之一[3]。大多數國家均對阿莫西林在動物食品中的最高殘留限量（MRLs）作出了規(guī)定。2002年，原農業(yè)部第235號公告規(guī)定了動物性食品中獸藥最高殘留限量（maximumresidue?limits，MRLs），其中阿莫西林在組織中的MRLs為50?μg/kg，在牛奶中的MRLs為10?μg/kg[4];日本厚生省頒布的《食品中農業(yè)化學品殘留限量》則規(guī)定阿莫西林在雞組織中MRLs為50?μg/kg，在雞蛋中為10?μg/kg[5];歐盟規(guī)定阿莫西林和氨芐西林在所有動物性食品中的MRLs為50?μg/kg，在牛奶中為4?μg/kg[6]。

筆者研究了阿莫西林在雞蛋中的殘留消除規(guī)律，規(guī)范阿莫西林在養(yǎng)殖中的科學合理合規(guī)使用，分析其不合理使用及濫用后對人類健康的潛在危害，旨在為保障動物源性食品和人類生命健康提供理論依據。

1?材料與方法

1.1?試驗材料

1.1.1?試驗藥物。

阿莫西林可溶性粉，有效成分30%，包裝規(guī)格100?g/袋，生產廠家為河南某公司;

阿莫西林可溶性粉，有效成分30%，包裝規(guī)格100?g/袋，生產廠家為山東某公司。

1.1.2?試驗動物。

健康成年已開產蛋雞90只，28周齡左右，體重為（1.80±0.20）kg。試驗前預飼14?d，飼喂不含任何抗菌藥物的全價飼料，自由飲水。

1.1.3?試驗儀器與耗材。

電子天平，規(guī)格0.1～1?000.0?g，為常熟市金羊砝碼儀器有限公司產品;阿莫西林殘留酶聯免疫檢測試劑盒，批號20190614，購自北京勤邦生物技術有限公司;其他耗材有腳標、5?mL注射器灌胃管等。

1.2?試驗方法

1.2.1?試驗分組。

成年健康已開產蛋雞90只，利用EXCEL隨機數字生成器分別對90只蛋雞隨機選擇，分為3組，每組30只。其中Ⅰ組為試驗組給予河南某公司的阿莫西林可溶性粉，Ⅱ組為對照組給予山東某公司的阿莫西林可溶性粉，Ⅲ組為空白對照組，不給藥，正常飼喂不含任何抗菌藥物的全價飼料。對所有雞只進行給藥前稱重，依據稱重結果進行給藥。

1.2.2?給藥方法。

阿莫西林按100?mg/kg體重劑量口服給藥，每日2次，連用5?d。投藥時將阿莫西林可溶性粉用水配成凈含量為40?mg/mL的水溶液。藥物現配現用，具體給藥方法見表1所示。

1.2.3?樣品收集與編號。

雞蛋樣品均在每天17：30—18：00收集，在收集后及時保存于4?℃冰箱中。收集日期為給藥期間（5?d）至停止給藥14?d。所有雞蛋編號原則為組別/日期。

1.2.4?樣品檢測。

采用阿莫西林殘留酶聯免疫檢測試劑盒，對采集的雞蛋樣品進行藥物含量檢測。

1.2.4.1?標準曲線的繪制。

根據試劑盒說明，取試劑盒中阿莫西林各標準品溶液，測定不同濃度標準品吸光度值，以百分吸光率[（B/B0）×100%]（B值為標準品或樣本溶液的平均吸光度值，B0為0?μg/kg?標準溶液的平均吸光度值）為縱坐標，以不同標準品濃度的對數值為橫坐標，繪制標準曲線，并推導出回歸方程，進行相關回歸分析。

1.2.4.2?試劑盒加標回收率試驗。

取一定體積的阿莫西林標準品溶液添加至空白雞蛋樣品，使樣品的藥物含量分別為100、20、10?μg/kg，每個濃度的樣品做2次平行。

阿莫西林雞蛋樣品前處理方法如下：稱?。?.0±0.05）g均質后的雞蛋樣本至10?mL聚乙烯離心管中加入2?mL去離子水，用渦旋儀渦動1?min，3?000?r/min室溫（20～25?℃）下離心5?min移取200?μL上清液至1.5?mL聚乙烯離心管中，再加入200?μL復溶工作液，用渦旋儀渦動1?min，混勻，取50?μL用于分析。

1.2.4.3?試劑盒精確度試驗。

取一定體積的阿莫西林標準品溶液添加至空白雞蛋樣品，使樣品的藥物含量分別為100、20、10?μg/kg，按試劑盒提供的方法樣品預處理后進行檢測。同一天內每個濃度重復5個樣品，取平均值，計算日內變異系數。

1.2.4.4?阿莫西林在雞蛋中的含量檢測。

檢測前，首先將所有的試劑必須恢復到室溫23～27?℃，任何不用的試劑須立即置于4?℃下保存。將采集的樣品按照步驟“1.2.4.2”相應的方法進行前處理。處理后，按照試劑盒的方法進行檢測。

預試驗：停止給藥后1、3、7?d，每組各取2個樣品，進行檢測，考察樣品濃度是否在標準曲線范圍內，若樣品濃度過高，需對樣品進行一定的稀釋后，再次進行檢測。

正式試驗：每次檢測時，均需制備2條標準曲線，保證此次檢測結果的可靠性。每個時間點，各組均檢測10個樣品，保證結果的真實性。

1.3?數據分析

通過試劑盒專用的數據處理軟件Ridawin，繪制標準曲線，對樣品檢測數據進行計算，得到對應的藥物濃度值，藥物濃度以μg/kg為單位。

每個時間點的雞蛋中的藥物濃度均10枚雞蛋的平均值（）±標準差（SD）表示，以此考察阿莫西林在雞蛋中的殘留消除。參考沈建忠等在2000年報道的國內常用實測濃度判斷法，該方法是以所有被檢測動物的各組織中藥物殘留量均低于MRLs所需要的時間作為休藥期[7]。同時，使用WT1.4軟件按95%置信區(qū)間計算阿莫西林在雞蛋的休藥期（WDT）。

2?結果與分析

2.1?樣品采集

按照給藥方法對雞只進行給藥，在第1天給藥后進行雞蛋采集，每組每日均采集15枚雞蛋，剩余雞蛋棄去。試驗期間共采集19?d，共收集855枚雞蛋。

2.2?標準曲線的制作

取試劑盒中的阿莫西林標準物（0、1.5、4.5、13.5、40.5、121.5?μg/kg）進行ELISA測定，以百分吸光率為縱坐標，以不同標準品濃度的對數值為橫坐標，繪制標準曲線，進行回歸分析，可知阿莫西林酶聯免疫試劑盒的線性關系良好（圖1）。

2.3?加標回收率試驗

取一定體積的阿莫西林標準品溶液添加至空白雞蛋樣品，使樣品的藥物含量分別為100、20、10?μg/kg，每個濃度做2個平行。樣品前處理后檢測，結果表明阿莫西林100、20、10?μg/kg的回收率分別為81.1%、852%和123.0%，與試劑盒說明書基本保持一致。

2.4?精確度試驗

取一定體積的阿莫西林標準品溶液添加至空白雞蛋樣品，使樣品的藥物含量分別為100、20、10?μg/kg，每個濃度重復檢測5次，計算變異系數，結果見表2。由表2可知，阿莫西林試劑盒的變異系數為4.02%，變異系數小于10%，表明重復性良好。

2.5?樣品的檢測

2.5.1?預試驗結果。

停藥后1、3、7?d的雞蛋樣品，每組各取2個樣品，檢測結果如表3所示。標準曲線最高濃度為121.5?μg/kg，前處理過程樣品被稀釋6倍，則最高可檢測濃度為729?μg/kg。由上述檢測最高濃度約387?μg/kg，未超過標曲最高線。因此，樣品不需要稀釋，可以直接進行檢測。

2.5.2?正式檢測。

每組每個時間點檢測10個樣品，空白對照組為未給藥的空白雞蛋，檢測結果均小于10?μg/kg，2個給藥組的具體檢測結果見表4。由表4可知，2組在給藥期間藥物濃度不斷升高，且均在停藥后第1天藥物濃度達到最高值，此后逐步降低;停藥后第9天后藥物濃度均低于10??μg/kg。

2.6?休藥期的計算

2.6.1?實測濃度判斷法。

在中國和歐美國家，雞蛋中阿莫西林均無最低殘留限量（MRLs），僅日本公布的雞蛋中阿莫西林的最低殘留限量（MRLs）為10?μg/kg。由檢測結果可知，2個廠家的阿莫西林均在停藥后第9天檢測濃度低于10?μg/kg，按照實測濃度法可判定其休藥期為停藥后第9天。

2.6.2?WT?1.4軟件計算法。

采用WT?1.4軟件按95%置信區(qū)間計算阿莫西林在雞蛋的休藥期（WDT）。阿莫西林在雞蛋中的休藥期數據擬合圖見圖2、3。由圖2、3可知，Ⅰ組和Ⅱ組阿莫西林在雞蛋中的休藥期分別為12.74和12.72?d。

3?討論與結論

在中國和歐美國家，雞蛋中阿莫西林均無最低殘留限量（MRLs），僅日本公布的雞蛋中阿莫西林的最低殘留限量（MRLs）為10?μg/kg。該試驗依據阿莫西林的給藥說明書（30%），按100?mg/kg體重劑量口服給藥，一日2次，連用5?d。結果表明，2個廠家的阿莫西林均在停藥后第1天，雞蛋中藥物殘留量達到最高值;藥物殘留量在停藥后迅速降低，且均在停藥后第9天檢測濃度低于MRLs（10?μg/kg），2個廠家的阿莫西林藥物代謝消除曲線基本重合。

休藥期（WDT）是指從停止給藥到允許動物屠宰或其產品上市的間隔時間。WDT可簡單理解為從停止給藥到保證組織中殘留濃度降至低于安全濃度MRLs需要的時間。WDT的計算方法主要有實測濃度判斷法[7]、回歸法[8]、群體藥動學方法[9]和非參數方法[10]。

沈建忠等[7]報道的國內常用實測濃度判斷法，是以所有被檢測動物各組織的藥物殘留均低于MRLs所需時間為休藥期。根據國內實測濃度判斷法，可初步判定阿莫西林在雞蛋的休藥期為停藥后第9天。

美國FDA規(guī)定使用回歸法測定WTD。該方法是將濃度作對數轉換后與時間做線性回歸，將回歸曲線的95%可信限的上限降至MRLs所需要時間為休藥期[8]。故一般經常使用休藥期軟件WT?1.4，采用回歸法計算得出的休藥期。采用WT?1.4軟件按95%置信區(qū)間計算阿莫西林在雞蛋的休藥期（WDT），2個廠家的阿莫西林再雞蛋中的休藥期分別為12.74和12.72?d。

Liu等[11]2017年研究表明，在25和50?mg/kg的劑量下，全蛋中所有殘留物的理論消除時間分別為8.00和911?d。

Xie等[12]2013年研究表明，50?mg/kg劑量下在全蛋中在停藥后第10.5天，徹底檢測不到阿莫西林。與該試驗檢測結果休藥期（12.74?d）基本保存一致。該試驗中阿莫西林在雞蛋中的代謝曲線與文獻[11-12]報道基本一致，均在停藥后第1天左右達到藥物濃度最高值。孫禮瑞等[13]在2015年研究報道的阿莫西林在雞組織中的殘留消除規(guī)律，結果是休藥后第5天阿莫西林殘留量低于最高殘留限量（50?μg/kg）;該試驗中雞蛋樣品在停藥后第5天藥物殘留量為40.22?μg/kg，與文獻報道基本一致。

迄今為止，國內外關于阿莫西林在雞蛋中的殘留研究極少，且多采用高效液相和質譜等的檢測方法，但其前處理方法復雜，包含液液提取、固相萃取凈化和衍生化等多步提取。該研究采用酶聯免疫試劑盒，快速檢測雞蛋中的阿莫西林殘留量，通過回收率和靈敏度驗證，證明方法的科學性和可行性。開展2個不同廠家的阿莫西林在蛋雞中的殘留消除試驗，試驗結果與文獻報道的消除曲線基本一致，且2個廠家的阿莫西林，在雞蛋中的殘留情況基本無差異。

該試驗結果表明，蛋雞在使用阿莫西林后，其在雞蛋中休藥期較長（12.74?d），且不同廠家的阿莫西林在雞蛋中的休藥期無差異，為臨床提供相關的科學數據和快速檢測的方法，防止獸醫(yī)臨床上的不合理使用，保障動物源性食品安全。

參考文獻

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