錢楊楊 吳中華 張靜 潘志強 劉小美

摘要：目的? 觀察黃連-大黃-肉桂復方及其組分配伍對人肝癌SMMC-7721及HepG2細胞增殖的影響，并從PI3K/AKT-FOXO3a通路探討其作用的分子機制。方法? 體外培養(yǎng)人肝癌SMMC-7721及HepG2細胞，采用MTT法分別檢測復方和復方中黃連、大黃、肉桂各自主要有效成分小檗堿、大黃素和桂皮醛不同配伍的肝癌細胞增殖;進一步以復方及有效組分最佳配伍（簡稱“組分”）作用肝癌細胞24 h，RT-qPCR檢測PI3K、AKT和FOXO3a mRNA表達，Western blot檢測PI3K p110、AKT、p-AKT、FOXO3a和p-FOXO3a蛋白表達。結果? 復方、小檗堿、大黃素和桂皮醛對肝癌細胞增殖具有抑制作用，并有較明顯的量效和時效關系，小檗堿、大黃素和桂皮醛最佳配伍比例分別為44、23、46 μmol/L;與對照組比較，復方和組分均能顯著上調人肝癌SMMC-7721及HepG2細胞FOXO3a mRNA表達，PI3K mRNA表達也呈上調趨勢，SMMC-7721細胞AKT mRNA表達顯著下調，但組分使HepG2細胞AKT mRNA表達顯著上調;復方和組分均可抑制PI3K p110、AKT及p-AKT蛋白表達，顯著促進FOXO3a蛋白表達，對p-FOXO3a蛋白表達有抑制趨勢。結論? 復方和組分均能抑制SMMC-7721、HepG2細胞增殖，其抗肝癌作用可能與PI3K/AKT的抑制和FOXO3a的激活有關。

關鍵詞：黃連-大黃-肉桂復方;組分配伍;肝癌細胞;PI3K/AKT-FOXO3a通路

中圖分類號：R285.5? ? 文獻標識碼：A? ? 文章編號：1005-5304（2020）04-0052-07

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.201909365

Effects of Coptidis Rhizoma - Rhei Radix et Rhizoma - Cinnamomi Cortex Compound and Its Component on Proliferation of Hepatoma SMMC-7721 and HepG2 Cells

QIAN Yangyang1， WU Zhonghua2， ZHANG Jing3， PAN Zhiqiang1， LIU Xiaomei1

1. School of Basic Medicine， Shanghai University of Traditional Chinese Medicine， Shanghai 201203， China;

2. Science and Technology Experiment Center， Shanghai University of Traditional Chinese Medicine ，

Shanghai 201203， China; 3. College of Acupuncture and Tuina， Shanghai University of

Traditional Chinese Medicine， Shanghai 201203， China

Abstract： Objective To observe the effects of Coptidis Rhizoma - Rhei Radix et Rhizoma - Cinnamomi Cortex compound and its component compatibility on proliferation of hepatoma SMMC-7721 and HepG2 cells; To explore the action mechanism in the phosphatidylinositol 3-kinase （PI3K） -protein kinase B （AKT） -forkhead factor 3 （FOXO3a） pathway. Methods The SMMC-7721 and HepG2 cells were cultured in vitro. MTT assay was used to determine the effect of Coptidis Rhizoma - Rhei Radix et Rhizoma - Cinnamomi Cortex compound and its main active component compatibility of berberine， emodin and cinnamaldehyde on the proliferation hepatoma cells， respectively. Furthermore， hepatoma cells were treated with the compound and the best compatibility for 24 hours. The mRNA expressions of PI3K， AKT and FOXO3a were detected by RTqPCR， and the protein expressions of PI3K p110， AKT， p-AKT， FOXO3a and p-FOXO3a were measured by Western Blot. Results The inhibitory effects of the compound， berberine， emodin and cinnamaldehyde on the proliferation of hepatoma cells were significant， with obvious dose-effect and time-effect relationship. The optimal compatibility ratio of berberine， emodin and?cinnamaldehyde was 44， 23， 46 μmol/L. Compared with the control group， both compound and component compatibility could significantly up-regulate the mRNA expression of FOXO3a in SMMC-7721 and HepG2 cells， and also up-regulate the mRNA expression of PI3K; the mRNA expression of AKT in SMMC-7721 cells was significantly down-regulated. However， the component compatibility made the mRNA expression of AKT remarkably up-regulated in HepG2 cells; Compared with the control group， compound and component compatibility could inhibit the protein expressions of PI3K p110， AKT and p-AKT， notably promote the protein expression of FOXO3a， and reduce the protein expression of p-FOXO3a. Conclusion Both compound and component compatibility can inhibit the proliferation of SMMC-7721 cells and HepG2 cells. The anti-hepatocarcinoma effect may be related to the inhibition of PI3K/AKT and the activation of FOXO3a.

Keywords： Coptidis Rhizoma - Rhei Radix et Rhizoma - Cinnamomi Cortex compound; component compatibility; hepatoma cells; PI3K/AKT-FOXO3a pathway

肝癌是常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率居全球第6位，由于起病隱匿，早期癥狀不明顯，進展迅速，侵襲性強，死亡率在全球惡性腫瘤中排第4位[1]。盡管目前肝癌診療技術已有很大進展，但大多患者發(fā)現時已至中晚期，治療效果不佳，治愈率仍有限，且常伴有不同程度的毒副作用。因此，從分子和基因出發(fā)，探索新的治療靶點，尋找效果顯著且毒副作用低的藥物尤為關鍵。中醫(yī)藥對肝癌有一定療效[2]，在改善癥狀、提高生存質量方面有著獨特優(yōu)勢[3]。在肝癌的發(fā)生發(fā)展中，熱、毒、瘀是常見的病理因素[4-6]。本研究選用的黃連-大黃-肉桂復方，以清熱解毒為主，又兼活血化瘀之功，原方是上海中醫(yī)藥大學柯雪帆教授治療早期熱盛陰未虛糖尿病患者經驗方，后期發(fā)現其不僅能有效降低血糖，亦能顯著抑制肝癌細胞增殖[7]，但作用機制尚不清楚;同時有文獻報道，復方中3味中藥各自的主要有效成分——黃連有效成分小檗堿、大黃有效成分大黃素、肉桂有效成分桂皮醛單獨使用時，均具有抗肝癌的作用[8-10]。鑒于有效成分單獨應用難以體現中藥方劑配伍理論，以及方劑有效組分配伍模式常為闡明復方起效成分的重要方法，本研究同步觀察復方及其3味中藥主要有效成分配伍對肝癌細胞增殖的抑制作用及其作用機制，以觀察組分配伍能否重現復方的抗肝癌作用，并基于磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）-蛋白激酶B（PKB，又稱AKT）-叉頭框轉錄因子3（FOXO3，又稱FOXO3a）通路比較兩者作用機理，為復方及其組分配伍治療肝癌提供新的實驗依據。

1? 實驗材料

1.1? 細胞株

人肝癌SMMC-7721細胞及HepG2細胞，購自中國科學院上海細胞研究所，為實驗室常規(guī)培養(yǎng)的細胞株。

1.2? 藥物

黃連-大黃-肉桂復方由黃連、大黃和肉桂（黃連∶大黃∶肉桂=9∶3∶1）組成，飲片均購自上海養(yǎng)和堂張江店，按文獻[7]方法，將三藥粉碎，按比例混合后加入8倍量70%乙醇浸泡30 min，80 ℃加熱回流1 h，過濾，濾渣加8倍量70%乙醇，80 ℃加熱回流1 h，過濾，合并濾液。旋轉蒸發(fā)回收乙醇并將藥物濃縮至1 g原藥材/mL，以氫氧化鈉顆粒調節(jié)pH值達7.2，抽濾滅菌，分裝，-80 ℃保存?zhèn)溆谩Ｊ褂们坝门囵B(yǎng)液和DMSO（終濃度為0.1%）稀釋至所需濃度。

小檗堿和大黃素均購自中國食品藥品檢定研究院，桂皮醛購自美國Sigma-Aldrich公司。配制方法：將小檗堿溶解為5 mmol/L母液（水溶），大黃素溶解為40 mmol/L母液（DMSO溶），桂皮醛溶解為5 mmol/L母液（DMSO溶），使用時再以培養(yǎng)液和DMSO（終濃度為0.1%）稀釋至所需濃度。

1.3? 主要試劑與儀器

胎牛血清（美國Corning公司），RPMI 1640培養(yǎng)液、胰酶、青霉素-鏈霉素（美國Gibco公司），Trizol試劑（美國Ambion公司），Prime Script RT reagent Kit、SYBR Premix Ex TaqTM（TliRNaseH Plus）Ⅱ（日本Takara公司），PI3K p110、AKT、p-AKT、FOXO3a、p-FOXO3a、GAPDH一抗、Anti-rabbit IgG二抗（美國CST公司），RIPA裂解液、PMSF蛋白酶抑制劑、BCA蛋白濃度測定試劑盒（增強型）、SDS-PAGE凝膠快速配制試劑盒、極超敏ECL化學發(fā)光試劑盒（上海碧云天生物科技公司）。5424R型Eppendorf臺式離心機（德國Eppendorf公司），NanoDrop2000（美國Thermo公司），Applied Biosystems實時熒光定量PCR儀（美國Thermo Fisher公司），Elx800型酶標儀（Biotek公司），FC-M型化學發(fā)光成像系統（美國ProteinSimple公司）。

2? 實驗方法

2.1? 細胞培養(yǎng)

人肝癌SMMC-7721、HepG2細胞復蘇后培養(yǎng)在RPMI1640培養(yǎng)液中，置于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每隔2 d換液1次，待細胞融合率達90%時，按1∶2傳代，待傳代3次后用于實驗。

2.2? 分組及給藥

選擇對數生長期SMMC-7721細胞，常規(guī)消化接種至96孔板，每孔5×103個細胞，鋪板過夜后分別加入不同濃度復方（0.25、0.5、1.0 mg/mL）及小檗堿（20、40、80 μmol/L）、大黃素（10、20、40 μmol/L）和桂皮醛（45、90、180 μmol/L），同時設空白孔和對照孔，用藥24、48 h后，吸棄培養(yǎng)液，每孔加0.5 mg/mL MTT溶液100 μL，置于37 ℃培養(yǎng)箱4 h后吸棄，再加150 μL/孔DMSO溶液，避光緩慢振搖10 min，酶標儀檢測490 nm波長處各孔吸光度（OD值），計算細胞存活率。細胞存活率（%）=（實驗孔OD值-空白孔OD值）÷（對照孔OD值-空白孔OD值）×100%，再根據用藥48 h數據，計算每種藥物半數抑制濃度（IC50）。

2.3? 優(yōu)化小檗堿、大黃素和桂皮醛最佳配伍

選擇對數生長期人肝癌SMMC-7721細胞，常規(guī)消化后接種至96孔板，每孔5×103個細胞，鋪板過夜后，基于小檗堿、大黃素和桂皮醛的IC50，采用U6（64）均勻設計表安排小檗堿、大黃素和桂皮醛的用藥劑量，劑量為各藥物的1/6 IC50～IC50，同時設空白孔和對照孔。用藥48 h后，吸棄培養(yǎng)液，MTT法檢測并計算各組藥物對細胞存活率的影響，并對數據進行逐步回歸分析，得回歸方程，確定最佳組分配伍（簡稱“組分”）。

2.4? 肝癌HepG2細胞增殖測定

以抑制SMMC-7721細胞增殖的復方IC50和組分作用于HepG2細胞24、48 h，MTT法檢測其對HepG2細胞增殖的抑制作用。

2.5? 實時熒光定量PCR檢測相關基因表達

選擇對數生長期SMMC-7721和HepG2細胞，常規(guī)消化后接種至6孔板，每孔3×105個細胞。按處理因素不同，設置對照組、復方組、組分組，分別給予0.1%DMSO、復方（0.86 mg/mL，含0.1%DMSO）和組分（小檗堿、大黃素、桂皮醛終濃度分別為44、23、46 μmol/L，含0.1%DMSO）。給藥24 h后，吸棄培養(yǎng)液，收集細胞，Trizol法提取總RNA，并用Prime Script RT reagent Kit將mRNA反轉錄成cDNA，反應條件：37 ℃、15 min，85 ℃、5 s。cDNA用SYBR Premix試劑進行實時熒光定量PCR，擴增條件：95 ℃、3 min;95 ℃、30 s，60 ℃、30 s，40個循環(huán);95 ℃、15 s，55 ℃、15 s，95 ℃、15 s。檢測基因及引物由Primer3（v.0.4.0）在線軟件設計并委托Sangon Biotech公司合成（見表1）。以GAPDH作為內參，用2-ΔΔCt表示mRNA相對表達量。

2.6? Western blot檢測相關蛋白表達

細胞鋪板、組別設置及用藥與“2.5”項下方法相同。用藥24 h后，用含有蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液裂解細胞，BCA法測定蛋白濃度，將提取的蛋白上樣25 μg進行SDS-PAGE電泳，之后將凝膠取下，將蛋白轉膜至PVDF膜，封閉，分別加入PI3K p110、AKT、p-AKT、FOXO3a、p-FOXO3a和內參GAPDH一抗抗體（p-FOXO3a為1∶250，其余均為1∶1000），4 ℃搖床輕搖孵育過夜，TBST洗滌，辣根過氧化物酶標記二抗，室溫孵育1.5 h，ECL試劑顯色，化學發(fā)光成像儀曝光顯影并記錄。結果用Image J分析，以GAPDH為內參，計算目的蛋白灰度值與內參蛋白灰度值的比值，作為蛋白相對表達量。

3? 統計學方法

采用SPSS21.0統計軟件進行分析。計量資料以—x±s表示，兩組比較采用t檢驗，多組比較采用方差分析。P<0.05表示差異有統計學意義。

4? 結果

4.1? 復方、小檗堿、大黃素和桂皮醛對人肝癌SMMC-7721細胞增殖的影響

復方、小檗堿、大黃素和桂皮醛作用SMMC-7721細胞24、48 h后，其細胞增殖抑制作用見圖1。與對照組比較，不同濃度復方（圖1A）、小檗堿（圖1B）、大黃素（圖1C）和桂皮醛（圖1D）對SMMC-7721細胞增殖抑制有明顯的量效和時效關系?；?8 h作用數據，計算各藥物抑制SMMC-7721細胞增殖IC50分別為黃連-大黃-肉桂復方0.86 mg/mL、小檗堿62 μmol/L、大黃素33 μmol/L和桂皮醛65 μmol/L。

4.2? 優(yōu)化小檗堿、大黃素和桂皮醛最佳配伍

U6（64）均勻設計小檗堿（X1）、大黃素（X2）和桂皮醛（X3）各自濃度，見表2。三者不同比例配伍作用于SMMC-7721細胞48 h，均可抑制細胞增殖，細胞存活率為40%～60%，以各配伍組細胞存活率（Y）進行逐步回歸分析，得多元回歸方程Y=82.486-0.348X1-0.502X2-0.229X3，其中r=0.932，F=149.556，<0.001。根據該方程，當SMMC-7721細胞達半數抑制時，計算得小檗堿、大黃素和桂皮醛的濃度分別為44、23、46 μmol/L，以此為最佳組分配伍，作為后續(xù)研究組分組。

4.3? 復方和組分對人肝癌HepG2細胞增殖的影響

復方和組分作用于HepG2細胞24、48 h后對其增殖的抑制作用見圖2。與對照組比較，復方和組分對HepG2細胞增殖的抑制有明顯的時效關系，藥物作用24 h后，復方與組分均可抑制細胞增殖，且差異有統計學意義（P<0.001，P<0.05），藥物作用48 h，復方和組分抑制細胞增殖效果更明顯（P<0.001）。此濃度對HepG2細胞抑制作用與SMMC-7721細胞近似，后續(xù)將采用該濃度作用于細胞，進行機制方面的研究。

4.4? 復方和組分對人肝癌SMMC-7721及HepG2細胞PI3K/AKT-FOXO3a相關基因表達的影響

SMMC-7721細胞中，與對照組比較，復方組和組分組均可上調PI3K p110的mRNA表達，其中復方組差異有統計學意義（P<0.01），復方組和組分組比較差異有統計學意義（P<0.01）;同時復方組和組分組均能顯著下調AKT和上調FOXO3a的mRNA表達（P<0.001）。見圖3。HepG2細胞中，與對照組比較，復方組和組分組均顯著上調PI3K p110和FOXO3a的mRNA表達，組分組AKT mRNA表達明顯高于對照組和復方組（P<0.01）。見圖4。

4.5? 復方和組分對人肝癌SMMC-7721及HepG2細胞PI3K/AKT-FOXO3a相關蛋白表達的影響

SMMC-7721細胞中，與對照組比較，復方組和組分組PI3K p110、AKT及p-AKT蛋白表達顯著降低，組分組下降更明顯;復方組和組分組FOXO3a蛋白表達明顯升高（P<0.05），組分組作用更明顯，p-FOXO3a表達幾乎無變化。見圖5。

HepG2細胞中，與對照組比較，復方組和組分組PI3K p110、AKT及p-AKT蛋白表達有降低的趨勢，其中組分組AKT蛋白表達下降明顯，差異有統計學意義（P<0.05）;復方組和組分組FOXO3a蛋白表達明顯升高，差異有統計學意義（P<0.05，P<0.01）;復方組和組分組p-FOXO3a蛋白表達有下降趨勢。見圖6。

5? 討論

目前用于肝癌防治的中藥包括復方及單體或單味藥，復方因其基于中醫(yī)基礎理論進行辨證論治而廣泛使用，但復方用藥多以飲片湯劑為主，其成分復雜、質量難控、機理難以闡明等限制了其現代化和標準化的進程;而單味藥或單體，特別是單體，其成分清晰，靶點明確，現階段研究日益增多，但使用中缺乏相應的中醫(yī)理論支持。本世紀初興起的基于方劑配伍理論和藥理機制開展的中藥有效組分配伍研究模式，因其質量可控、安全有效、機理清楚，且符合中醫(yī)整體觀、辨證論治用藥的原則，成為目前方劑配伍研究新的發(fā)展趨勢[11]。值得注意的是，方劑配伍用藥大多通過提取有效成分或靶向分子構成，而忽略了對機體整體狀態(tài)的影響，因此在研究組分配伍時，關注藥效研究的同時，也要關注藥性對機體整體的調節(jié)作用。黃連-大黃-肉桂復方中，黃連、大黃均屬大寒之品，佐以少量熱性藥肉桂以制之，藥性平緩，發(fā)揮清熱解毒之功，從而達到抗肝癌效果。組分是將復方中具有抗肝癌作用的有效組分——小檗堿、大黃素、桂皮醛組合配伍使用，已有研究報道，三者均與其飲片具有相似的寒熱屬性[12-13]。因此，探索和優(yōu)化有效復方來源的組分配伍中藥，有望實現基于中醫(yī)辨證論治和方劑配伍理論，開發(fā)成分清晰、質量可控、機制易于闡明的組分配伍新藥，對發(fā)揮中藥治療優(yōu)勢及中醫(yī)藥客觀化和標準化有重要的理論意義，對臨床也有應用價值。

PI3K/AKT信號通路是細胞內非常重要的信號轉導途徑之一，在調控細胞代謝、蛋白合成等方面發(fā)揮重要作用[14]。研究發(fā)現，抑制PI3K/AKT通路能抑制腫瘤細胞增殖，促進細胞凋亡[15-16]。FOXO3a是PI3K/AKT通路下游的一個重要分子，是FOXO叉頭轉錄因子亞家族的成員，也是腫瘤細胞凋亡周期調控的關鍵因子[17]。被AKT磷酸化后，FOXO3a從細胞核移至細胞質，導致其失活。研究表明，激活FOXO3a可上調細胞凋亡因子，從而促進細胞凋亡和周期阻滯，抑制腫瘤發(fā)生和發(fā)展[18]。因此，抑制PI3K/AKT和激活FOXO3a是治療肝癌的有效途徑。

本研究發(fā)現，藥物對不同細胞系的作用強度存在差異：復方及組分均能有效抑制人肝癌SMMC-7721和HepG2細胞的增殖;同等濃度下藥物對SMMC-7721細胞抑制作用強于HepG2細胞，由此導致藥物對2個不同細胞系PI3K p110-AKT-FOXO3a通路中關鍵分子mRNA和蛋白表達的影響趨勢一致，但以SMMC-7721細胞各分子變化程度更明顯，提示藥物敏感性存在個體差異。藥物對部分分子mRNA和蛋白表達的調控不同步：復方和組分均可致2個細胞系PI3K p110的mRNA表達及HepG2細胞AKT的mRNA表達升高，卻能使同一樣本這些分子的蛋白表達明顯降低，提示藥物雖然能激活這些分子的轉錄，卻抑制其翻譯過程，使其作用功能降低，抑制翻譯的具體環(huán)節(jié)還有待進一步研究。復方與組分部分作用存在差異：在濃度設置中，復方和組分均取自致SMMC-7721細胞半數抑制的濃度，即對SMMC-7721細胞增殖的抑制作用相當，此濃度下組分對HepG2細胞增殖的抑制作用稍低于復方，但有關分子的蛋白表達變化顯示，組分作用均優(yōu)于復方。提示除小檗堿、大黃素和桂皮醛外，復方中其他成分也有抑制肝癌細胞增殖作用，其機制除PI3K p110-AKT-FOXO3a通路參與外，可能還有其他途徑，這與復方多途徑、多靶點發(fā)揮作用的理論相一致;而成分清晰的組分雖然作用強度稍低于復方，但在靶點選擇上可能更集中，作用強度更大。

綜上，復方和組分均能抑制人肝癌SMMC-7721及HepG2細胞的增殖，其機制可能與PI3K/AKT的抑制和FOXO3a活化有關，以FOXO3a活化最明顯，兩藥的作用及其機制存在一定差異。當然，肝癌的發(fā)生機制復雜，影響因素較多，復方及組分發(fā)揮抗肝癌作用是否存在其他的靶點，還需進一步研究。

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（收稿日期：2019-09-25）

（修回日期：2019-10-15;編輯：華強）

基金項目：國家自然科學基金（81503481）;上海中醫(yī)藥大學中醫(yī)基礎理論學科能力提升項目（A1-Z193020110）

通訊作者：劉小美，E-mail：wfjlxm2005@126.com