陳博威 周勝?gòu)?qiáng) 易健 張文將 劉柏炎

摘要：目的? 觀察補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)Cav-1-/-小鼠腦缺血模型PI3K、Akt、PTEN表達(dá)的影響，探討其可能的作用機(jī)制。方法? 將野生型小鼠（WT）及Cav-1-/-小鼠（KO）隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組與補(bǔ)陽(yáng)組。采用大腦中動(dòng)脈栓塞法制備腦缺血模型，干預(yù)10 d后運(yùn)用Ayelet Levy 14分評(píng)分法觀察小鼠神經(jīng)功能評(píng)分。免疫組化和qRT-PCR分別檢測(cè)小鼠腦組織PI3K、Akt、PTEN蛋白和mRNA的表達(dá)。結(jié)果? 與假手術(shù)組比較，各模型組小鼠均出現(xiàn)明顯神經(jīng)功能障礙（P<0.01），且PI3K、Akt蛋白和mRNA表達(dá)明顯升高（P<0.01），PTEN蛋白和mRNA表達(dá)明顯降低（P<0.01），WT模型組小鼠腦組織PI3K、Akt、PTEN蛋白和mRNA表達(dá)更顯著，且神經(jīng)功能評(píng)分優(yōu)于KO模型組（P<0.01，P<0.05）;WT補(bǔ)陽(yáng)組小鼠腦組織PI3K、Akt、PTEN蛋白和mRNA的調(diào)控程度及神經(jīng)功能恢復(fù)程度均優(yōu)于WT模型組和KO補(bǔ)陽(yáng)組（P<0.01）。結(jié)論? 補(bǔ)陽(yáng)還五湯可能通過(guò)Cav-1調(diào)控PI3K/Akt信號(hào)通路活性，發(fā)揮抗腦缺血損傷的作用。

關(guān)鍵詞：補(bǔ)陽(yáng)還五湯;腦缺血;PI3K/Akt信號(hào)通路;Cav-1基因敲除;小鼠

中圖分類號(hào)：R285.5? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A? ? 文章編號(hào)：1005-5304（2020）04-0035-06

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.201910455

Effects of Buyang Huanwu Decoction on Expressions of PI3K， Akt， PTEN

in Cav-1-/- Mice after Cerebral Ischemia

CHEN Bowei1， ZHOU Shengqiang2， Yi Jian3， ZHANG Wenjiang1，4， LIU Baiyan1，4

1. Hunan University of Chinese Medicine， Changsha 410208， China;

2. Affiliated Hospital of Hunan Provincial Academy of Chinese Medicine， Changsha 410006， China;

3. The First Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine， Changsha 410007， China;

4. Yiyang Medical College， Yiyang 413000， China

Abstract： Objective To observe the effects of Buyang Huanwu Decoction on expressions of PI3K， Akt and PTEN after cerebral ischemia in Cav-1-/-mice; To discuss its possible mechanism. Methods Wild type mice （WT） and Cav-1-/-mice （KO） were randomly divided into sham-operation group， model group and Buyang Huanwu Decoction group. Cerebral ischemia model was established by middle cerebral artery occlusion. After 10 days of intervention， the neurological function scores of each group were observed by Ayelet Levy 14 points. Immunohistochemistry and qRT-PCR were used to detect the expressions of PI3K， Akt， PTEN protein and mRNA. Results Compared with sham-operation group， there were obvious neurological dysfunction in each model group （P<0.01）， and the expressions of PI3K， Akt protein and mRNA increased significantly （P<0.01）， PTEN protein and mRNA decreased significantly （P<0.01）. Besides， PI3K， Akt， PTEN proteins and mRNA expression in WT model group was more significant and the neurological function score was better than that of KO model group （P<0.01， P<0.05）. In addition， the degree of protein and mRNA regulation and neurological function recovery in WT Buyang Huanwu Decoction group?was better than that in WT model group and KO Buyang Huanwu Decoction group （P<0.01）. Conclusion Buyang Huanwu Decoction may play an anti-cerebral ischemic injury role by regulating the activity of PI3K/Akt signaling pathway through Cav-1.

Keywords： Buyang Huanwu Decoction; cerebral ischemia; PI3K/Akt signaling pathway; Cav-1 gene knockout; mice

缺血性腦血管疾病因其高發(fā)病率、高死亡率和高致殘率給社會(huì)、家庭及個(gè)人帶來(lái)沉重的痛苦和負(fù)擔(dān)[1]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，Cav-1在腦缺血損傷中可抑制炎癥反應(yīng)、降低缺血側(cè)半暗帶自噬及促進(jìn)血管新生[2-4]，達(dá)到促進(jìn)神經(jīng)恢復(fù)的作用。PI3K/Akt信號(hào)通路是一條能調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)、分化及自噬的經(jīng)典通路，對(duì)腦缺血損傷具有保護(hù)作用[5]。有研究表明，Cav-1可通過(guò)調(diào)控PI3K/Akt通路治療疾病[6-7]，但Cav-1是否調(diào)控PI3K/Akt通路對(duì)腦缺血后腦保護(hù)作用產(chǎn)生影響，迄今未見(jiàn)報(bào)道。補(bǔ)陽(yáng)還五湯為治療缺血性中風(fēng)氣虛血瘀證的經(jīng)典名方，其療效已被臨床證實(shí)[8]。本研究以Cav-1基因敲除小鼠作為研究對(duì)象，通過(guò)觀察腦缺血小鼠神經(jīng)功能評(píng)分與PI3K/Akt通路相關(guān)指標(biāo)的蛋白與mRNA變化，探討補(bǔ)陽(yáng)還五湯干預(yù)腦缺血小鼠的作用機(jī)制。

1? 實(shí)驗(yàn)材料

1.1? 動(dòng)物

健康雄性Cav-1-/-小鼠（KO）與同源野生型C57（WT）小鼠各40只。其中Cav-1-/-小鼠購(gòu)自美國(guó)Jackson Laboratory，批號(hào)2909619，湖南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物中心自行繁衍，均經(jīng)PCR鑒定為Cav-1基因敲除[9]，自由攝食飲水。

1.2? 藥物

補(bǔ)陽(yáng)還五湯（黃芪120 g，當(dāng)歸尾6 g，川芎3 g，紅花3 g，赤芍4.5 g，桃仁3 g，地龍3 g），飲片購(gòu)自湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院。常規(guī)煎煮后濃縮至含2 g原藥材/mL，冷藏備用。

1.3? 主要試劑與儀器

PI3K抗體、Akt抗體、PTEN抗體、SABC-POD試劑盒（武漢博士德公司，批號(hào)依次為BA1353-1、BA1512、BM4114、SA1022）。EG1150H石蠟包埋機(jī)（德國(guó)萊卡公司），RM2235切片機(jī)（德國(guó)萊卡公司），BX71顯微鏡（日本奧林巴斯公司），TRIzol Reagent（美國(guó)Life Technologies公司），Rever tAid First Strand cDNA Synthesis Kit（美國(guó)Thermo公司），PCR引物（上海生工合成），PCR擴(kuò)增儀（美國(guó)Bio-Rad公司），核酸水平電泳儀（北京百晶生物技術(shù)有限公司），核酸蛋白濃度測(cè)定儀（英國(guó)BIO-DROP公司）。

2? 實(shí)驗(yàn)方法

2.1? 分組、造模與給藥

將KO組和WT組按隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組、模型組及補(bǔ)陽(yáng)組，運(yùn)用大腦中動(dòng)脈栓塞法復(fù)制腦缺血模型，每組12只。將小鼠麻醉后固定，取頸正中切口，游離左側(cè)頸總、頸內(nèi)、頸外動(dòng)脈，依次結(jié)扎頸總、頸外動(dòng)脈。于頸總動(dòng)脈分叉部下方0.2～0.3 cm處剪一小口，將魚(yú)線通過(guò)頸總動(dòng)脈，插入頸內(nèi)動(dòng)脈，遇輕微阻力后停止進(jìn)線，深度（7.5±0.5）mm，固定魚(yú)線并逐層縫合。假手術(shù)組僅切開(kāi)皮膚、分離頸內(nèi)、頸外動(dòng)脈后即縫合。術(shù)后2 h參照Longa等[10]5分法進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分。分值在1～3分表明造模成功，予以納入研究。補(bǔ)陽(yáng)組術(shù)后2 h給藥，給藥劑量為每日18.5 g/kg（按70 kg成人與動(dòng)物體質(zhì)量藥量折算表?yè)Q算）補(bǔ)陽(yáng)還五湯藥液，灌胃體積按0.2 mL/10 g體質(zhì)量，模型組和假手術(shù)組動(dòng)物均給予等體積蒸餾水。每日1次，連續(xù)10 d。

2.2? 檢測(cè)指標(biāo)

2.2.1? 神經(jīng)功能評(píng)分

運(yùn)用Ayelet Levy 14分評(píng)分法[11]評(píng)估神經(jīng)功能。①提住尾巴將小鼠逐漸提高：前肢屈曲計(jì)1分，后肢屈曲計(jì)1分，30 s內(nèi)頭移動(dòng)與縱軸形成角度>10°計(jì)1分;②將大鼠置于地面：正常爬行計(jì)0分，無(wú)法直線爬行計(jì)1分，沿患側(cè)轉(zhuǎn)圈計(jì)2分，患側(cè)跌倒計(jì)3分;③梁平衡測(cè)試：靜態(tài)姿勢(shì)下可平衡計(jì)0分，抓握梁邊計(jì)1分，抱住梁、有一肢體掉落計(jì)2分，抱住梁、有兩肢體掉落，或在梁上旋轉(zhuǎn)（>60 s）計(jì)3分，試圖在梁上保持平衡但跌落（>40 s）計(jì)4分，試圖在梁上保持平衡但跌落（>20 s）計(jì)5分，跌落且沒(méi)有試圖保持平衡或抓梁（<20 s）計(jì)6分;④反射缺失或異常動(dòng)作：耳廓反射（當(dāng)觸耳道時(shí)搖頭）計(jì)1分，角膜反射（用棉花絲輕觸角膜可閉眼）計(jì)1分。

2.2.2? 免疫組化檢測(cè)蛋白表達(dá)

小鼠處死后，4%多聚甲醛固定大腦，脫水，常規(guī)包埋，切片，厚度約4 μm，依次烤片、脫蠟水化，3%過(guò)氧化氫去離子水滅活，熱修復(fù)抗原，BSA封閉液封閉，適量一抗4 ℃冰箱過(guò)夜，PBS沖洗后二抗孵育，再次PBS沖洗，滴加SABC孵育，最后DAB顯色并梯度脫水，透明，封片。每只大鼠取5張切片，光學(xué)顯微鏡（200倍）鏡下觀察，運(yùn)行Image Pro Plus 6.0圖像分析軟件計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。另因一抗特性不同，PTEN在DAB染色后再用蘇木素復(fù)染，光學(xué)顯微鏡（200倍）鏡下觀察，運(yùn)行ImagePro Plus6.0圖像分析軟件計(jì)算平均光密度。

2.2.3? qRT-PCR檢測(cè)mRNA表達(dá)

從引物銀行下載基因序列，用Primer premier 6.0進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，由上海生工生物工程有限公司合成，引物序列見(jiàn)表1。運(yùn)用Trizol法提取腦組織總RNA;檢測(cè)RNA濃度及質(zhì)量;兩步法反轉(zhuǎn)錄cDNA;PCR反應(yīng)：預(yù)變性95 ℃、2 min，變性95 ℃、15 s，退火58.2～60.8 ℃，40個(gè)循環(huán)。溶解曲線反應(yīng)程序：95 ℃、15 s，60 ℃、15 s，溫度緩慢上升（20 min）。β-actin為內(nèi)參基因，用2-ΔΔCt進(jìn)行相對(duì)定量，表示該基因相對(duì)表達(dá)量。ΔCt值=基因Ct值-內(nèi)參Ct值，ΔΔCt值=實(shí)驗(yàn)組ΔCt值-對(duì)照組ΔCt值。

3? 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)軟件及Graphpad Prism 8作圖軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料以—x±s表示，符合正態(tài)性分布，組間比較采用方差分析。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4? 結(jié)果

4.1? 補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)模型小鼠神經(jīng)功能的影響

假手術(shù)組小鼠無(wú)神經(jīng)功能障礙;各模型組小鼠出現(xiàn)明顯神經(jīng)功能障礙（P<0.01），且KO比WT神經(jīng)功能損傷更嚴(yán)重（P<0.05）;補(bǔ)陽(yáng)組小鼠神經(jīng)功能評(píng)分較模型組明顯降低（P<0.05，P<0.01），但KO補(bǔ)陽(yáng)組效果差于WT補(bǔ)陽(yáng)組（P<0.01）。見(jiàn)表2。

4.2? 補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)模型小鼠PI3K、Akt、PTEN蛋白表達(dá)的影響

與假手術(shù)組比較，KO模型組較WT模型組小鼠PI3K、Akt蛋白表達(dá)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），PTEN蛋白表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）;與KO比較，WT變化更顯著（P<0.05，P<0.01）;與WT模型組比較，WT補(bǔ)陽(yáng)組各蛋白表達(dá)變化更顯著，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），而KO補(bǔ)陽(yáng)組調(diào)控程度不及WT補(bǔ)陽(yáng)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。見(jiàn)圖1～圖6。

4.3? 補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)模型小鼠PI3K、Akt、PTEN mRNA表達(dá)的影響

與假手術(shù)組比較，KO模型組與WT模型組PI3K、Akt mRNA表達(dá)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），PTEN mRNA表達(dá)明顯降低（P<0.01），與KO比較，WT變化更顯著（P<0.05，P<0.01）。WT補(bǔ)陽(yáng)組與WT模型組比較，各指標(biāo)表達(dá)的變化更顯著，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），而KO補(bǔ)陽(yáng)組調(diào)控程度不及WT補(bǔ)陽(yáng)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），與蛋白表達(dá)相似。見(jiàn)圖7。

5? 討論

補(bǔ)陽(yáng)還五湯由王清任所創(chuàng)，常用于治療缺血性中風(fēng)氣虛血瘀之證。王氏認(rèn)為元?dú)獠赜谏眢w“氣管之內(nèi)，分布周身，左右各得一半”，中風(fēng)后半身不遂是因元?dú)馓潛p，則“經(jīng)絡(luò)自然空虛，有空虛之隙，難免其氣向一邊歸并”，若元?dú)庵皇Ｏ挛宄?，致元?dú)鈿w于半身而致對(duì)側(cè)半身不遂。因此治療上需補(bǔ)充虧損半身的五成元?dú)狻Ｋ^“補(bǔ)陽(yáng)”即補(bǔ)氣，氣為陽(yáng)，“還五”即恢復(fù)半身虧損的元?dú)?，由此可保證全身元?dú)馐?，恢?fù)偏癱肢體。王氏指出“元?dú)饧忍?，必不能達(dá)于血管，血管無(wú)氣，必停留而瘀”，氣虛血行不利，必導(dǎo)致血瘀。本方重用黃芪為君藥，以大補(bǔ)元?dú)?配以當(dāng)歸尾活血和血，為臣藥;紅花、桃仁、川芎、赤芍助當(dāng)歸活血祛瘀，地龍長(zhǎng)于行散走竄，通經(jīng)活絡(luò)，均為佐藥。諸藥合用，使氣旺促血行，活血而不傷正，則筋肉得養(yǎng)，痿廢可愈。課題組前期研究表明，補(bǔ)陽(yáng)還五湯能在腦缺血后通過(guò)降低炎癥反應(yīng)[12]、抑制細(xì)胞凋亡[13]、促進(jìn)血管新生[4]、減少細(xì)胞自噬[14]等途徑發(fā)揮抗腦缺血損傷作用。

PI3K/Akt通路是細(xì)胞一條關(guān)鍵的信號(hào)通路，廣泛參與調(diào)控細(xì)胞增殖、分化及凋亡的各個(gè)過(guò)程[5]。腦缺血后機(jī)體受到刺激會(huì)釋放各類酪氨酸激酶活性受體激活的物質(zhì)，這些受體能特異性活化PI3K，當(dāng)PI3K激活后，會(huì)將PIP2轉(zhuǎn)化成PIP3，激活A(yù)Kt。Akt作為一種重要的信息分子，不僅能繼續(xù)激活下游哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信號(hào)因子及B淋巴細(xì)胞瘤-2基因（Bcl-2）、Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bax）等調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、自噬與凋亡[15]，還能通過(guò)減少腫瘤壞死因子-α和白細(xì)胞介素-1β的釋放減輕腦缺血后炎癥損傷[16]。而PTEN能逆轉(zhuǎn)PIP2向PIP3的轉(zhuǎn)化，起到對(duì)整個(gè)通路的負(fù)性調(diào)控作用[17]。另有研究表明，PI3K/AKt信號(hào)通路還能在腦缺血后通過(guò)誘導(dǎo)神經(jīng)再生[18]、抑制氧化應(yīng)激[19]、促進(jìn)血管新生[20]等方式，在腦缺血后恢復(fù)中扮演重要角色。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，腦缺血后小鼠PI3K、Akt的蛋白及mRNA表達(dá)上升，PTEN的蛋白及mRNA表達(dá)被抑制，但整體活化程度有限，無(wú)法完全修復(fù)受損神經(jīng)，仍有明顯神經(jīng)功能缺損。補(bǔ)陽(yáng)還五湯的干預(yù)使相關(guān)蛋白調(diào)控作用更明顯，并能顯著改善神經(jīng)功能。我們推測(cè)補(bǔ)陽(yáng)還五湯可能通過(guò)調(diào)控PI3K/Akt通路，發(fā)揮抗腦缺血損傷的作用。

小窩是一種特殊形式的脂筏，位于細(xì)胞膜表面的特異性凹陷區(qū)，在神經(jīng)元及膠質(zhì)細(xì)胞膜上有豐富的表達(dá)。Cav-1是小窩中重要的功能結(jié)構(gòu)與核心蛋白，通過(guò)“腳手架結(jié)構(gòu)區(qū)”可與下游各類效應(yīng)因子結(jié)合，廣泛參與細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、凋亡等病理生理過(guò)程[21]。課題組前期發(fā)現(xiàn)，Cav-1是治療中風(fēng)的潛在靶點(diǎn)：正常腦內(nèi)有少量Cav-1表達(dá)，腦缺血后Cav-1迅速增加，Cav-1-/-小鼠腦梗死面積縮小速度明顯低于正常小鼠，神經(jīng)功能恢復(fù)也明顯減緩[22];Cav-1敲除可降低缺血腦組織血管新生[4]及神經(jīng)干細(xì)胞的增殖[23]。有研究表明，PI3K/Akt通路存在于小窩中并受到Cav-1的調(diào)控，抑制Cav-1可呈量效關(guān)系減弱Akt的活化[24]。也有研究表明，Cav-1能阻斷PI3K/Akt通路來(lái)抑制胰腺癌的生長(zhǎng)，并且Cav-1還可通過(guò)抑制神經(jīng)酰胺的釋放[25]，激活A(yù)kt信號(hào)通路，阻止細(xì)胞凋亡。據(jù)此，我們推測(cè)Cav-1可能通過(guò)調(diào)控PI3K/Akt通路發(fā)揮抗腦缺血的作用。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)陽(yáng)還五湯能改善腦缺血后的神經(jīng)功能，其機(jī)制可能與調(diào)控PI3K/Akt通路有關(guān)。同時(shí)KO與WT比較，小鼠腦缺血后神經(jīng)功能評(píng)分改善較低，PI3K/Akt通路相關(guān)因子表達(dá)受損，提示補(bǔ)陽(yáng)還五湯可能是通過(guò)Cav-1調(diào)控PI3K/Akt信號(hào)通路的活性，促進(jìn)神經(jīng)恢復(fù)。

綜上所述，本研究初步發(fā)現(xiàn)補(bǔ)陽(yáng)還五湯可能通過(guò)Cav-1調(diào)控PI3K/Akt信號(hào)通路的活性發(fā)揮抗腦缺血損傷的作用，但目前尚無(wú)法確定其作用機(jī)制與PI3K/Akt信號(hào)通路上調(diào)相關(guān)。今后課題組將采取Cav-1基因敲除及PI3K/Akt抑制劑雙重阻斷Cav1/PI3K/Akt信號(hào)通路的方式，希望進(jìn)一步明確補(bǔ)陽(yáng)還五湯抗腦缺血損傷的作用機(jī)制。

參考文獻(xiàn)：

[1] BENJAMIN E， BLAHA M， CHIUVE S， et al. Heart disease and stroke statistics-2017 update：A report from the American Heart Association[J]. Circulation，2017，131（4）：e29.

[2] 黃素芬，周勝?gòu)?qiáng)，羅東，等.陷窩蛋白-1對(duì)永久性大腦中動(dòng)脈閉塞小鼠缺血皮質(zhì)白細(xì)胞介素-1β和白細(xì)胞介素-6表達(dá)的影響[J].國(guó)際腦血管病雜志，2016，24（11）：1022-1027.

[3] 周勝?gòu)?qiáng).補(bǔ)陽(yáng)還五湯調(diào)控Cav1/mTOR/ULK1通路介導(dǎo)的自噬抗腦缺血損傷機(jī)制研究[D].長(zhǎng)沙：湖南中醫(yī)藥大學(xué)，2017.

[4] 王華.補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)caveolin-1敲除小鼠腦缺血后血管新生的作用及機(jī)理研究[D].長(zhǎng)沙：湖南中醫(yī)藥大學(xué)，2014.

[5] 匡巍，余昌胤.磷脂酰肌醇-3磷酸激酶/AKT/雷帕霉素靶蛋白信號(hào)通路參與中樞神經(jīng)損傷保護(hù)與修復(fù)的研究進(jìn)展[J].安徽醫(yī)藥，2018，22（2）：215-219.

[6] 丁珊珊，康潔，張凌媛，等.二陳湯對(duì)脂代謝紊亂小鼠Cav-1和PI3K/AKT表達(dá)的影響[J].中華中醫(yī)藥雜志，2017，32（1）：242-244.

[7] 王曉輝，李非，鄭亞民，等.caveolin-1通過(guò)阻斷PI3K/Akt信號(hào)的激活抑制胰腺癌細(xì)胞增殖[J].中國(guó)普外基礎(chǔ)與臨床雜志，2011，18（10）：1054-1059.

[8] HAO C Z， WU F， SHEN J， et al. Clinical efficacy and safety of Buyang Huanwu decoction for acute ischemic stroke：a systematic review and meta-analysis of 19 randomized controlled trials[J]. Evid Based Complement Alternat Med，2012，2012：630124.

[9] 周勝?gòu)?qiáng)，羅東，黃素芬，等.Caveolin-1基因敲除小鼠子代基因型的鑒定及繁育方法[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)報(bào)，2016，24（3）：228-232.

[10] LONGA E， WEINSTEIN P， CARLSON S， et al. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats[J]. Stroke， 1989，20（1）：84.

[11] LEVY A， BERCOVICH-KINORI A， ALEXANDROVICH A G， et al. CD38 facilitates recovery from traumatic brain injury[J]. Journal of Neurotrauma，2009，26（9）：1521-1533.

[12] 郭樂(lè)，周賽男，藺曉源，等.補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)腦缺血后大鼠NF-κB/p50表達(dá)的影響[J].中醫(yī)藥信息，2014，31（4）：98-101.

[13] 廖亮英，蔡光先，周賽男.補(bǔ)陽(yáng)還五湯超微飲片對(duì)局灶性腦缺血大鼠神經(jīng)干細(xì)胞移植后Bcl-2、Bax表達(dá)的影響[J].湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)， 2018，38（3）：257-260.

[14] 周勝?gòu)?qiáng)，易健，周賽男，等.補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)局灶性腦缺血小鼠半暗帶細(xì)胞自噬水平的影響[J].湖南中醫(yī)雜志，2017，33（2）：119-123.

[15] 仇志富，顏勇，吳曉光.PI3K/Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與神經(jīng)細(xì)胞凋亡研究進(jìn)展[J].中風(fēng)與神經(jīng)疾病雜志，2015，32（10）：952-953.

[16] 涂獻(xiàn)坤，楊濱，涂德文，等.PI3K/Akt通路在丙泊酚減輕大鼠腦缺血性損傷中的作用[J].中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2019，35（5）：630-633.

[17] GEORGESCU M. PTEN tumor suppressor network in PI3K-Akt pathway control[J]. Genes & Cancer，2010，12：1170-1177.

[18] 劉馨雨.人參皂苷Rd通過(guò)激活PI3K/Akt通路促進(jìn)腦缺血/再灌注大鼠神經(jīng)發(fā)生的作用[D].北京：北京中醫(yī)藥大學(xué)，2015.

[19] 孫明爍.通心絡(luò)通過(guò)PI3K/Akt通路對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷的治療作用及其機(jī)制研究[D].長(zhǎng)春：吉林大學(xué)，2018.

[20] 李磊，高絢照，馬連萍，等.積雪草苷通過(guò)激活PI3K/Akt信號(hào)通路緩解局灶性腦梗死大鼠腦組織損傷和誘導(dǎo)血管新生[J].中國(guó)免疫學(xué)雜志， 2019，35（17）：2068-2072.

[21] KARAJEWSKA W M， MASTOWSKA I. Caveolins：structure and function in signal transduction[J]. Cellular & Molecular Biology Letters， 2004，9（2）：195-220.

[22] 劉柏炎，沈劍剛，蔡光先，等.補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)局灶性腦缺血大鼠腦內(nèi)caveolin1、2的影響[J].湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，28（1）：22-24.

[23] 周勝?gòu)?qiáng)，易健，劉柏炎.補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)Cav1/Notch1/Hes1通路在小鼠腦缺血后海馬NSCs增殖中的作用[J].中藥新藥與臨床藥理，2016， 27（6）：804-810.

[24] GUO Z， HU X， XING Z， et al. Baicalein inhibits prostate cancer cell growth and metastasis via the caveolin-1/AKT/mTOR pathway[J]. Molecular and Cellular Biochemistry，2015，406（1/2）：111-119.

[25] WU P， QI B， ZHU H， et al. Suppression of staurosporine-mediated apoptosis in Hs578T breast cells through inhibition of neutral- sphingomyelinase by caveolin-1[J]. Cancer Letters，2007，256（1）：72.

（收稿日期：2019-10-29）

（修回日期：2019-11-19;編輯：華強(qiáng)）

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（81273989）;湖南省自然科學(xué)基金（2018JJ2413）;湖南省中醫(yī)藥管理局項(xiàng)目（2015140）

通訊作者：劉柏炎，E-mail：liubaiyan@126.com