張亦琳，延永，賀燕玲

（商洛學(xué)院 生物醫(yī)藥與食品工程學(xué)院，陜西商洛 726000）

苦丁茶（Ilex kudingcha），屬冬青科（Aquifoliaceae）冬青屬常綠喬木，山坡、竹林、灌木叢中常見，在我國西南地區(qū)及華南地區(qū)廣泛分布[1]。據(jù)記載，這種植物已經(jīng)作為藥草使用了2000 多年，因其獨(dú)特作用而受到科學(xué)家的廣泛關(guān)注。豐富的黃酮類物質(zhì)[2]、氨基酸[3]、苦味苷[4]等物質(zhì)是苦丁茶獨(dú)具特色之處，而黃酮類物質(zhì)具有抑菌[5]、抗皮膚衰老[6-7]和消除自由基[8]的作用，一直以來是研究的熱點(diǎn)。隨著國際社會(huì)對(duì)化學(xué)藥品給人類社會(huì)造成潛在危害的反思和回歸自然的呼聲不斷提高，許多國家日益重視天然藥物的研究和開發(fā)，這是我國的中藥發(fā)展非常難得的機(jī)遇。據(jù)《本草綱目》記載，雨水、井水、露水對(duì)中草藥進(jìn)行煎煮后，其藥效各有所不同[9]，其本質(zhì)原因是雨水、井水、露水的硬度不同，而硬水中離子含量最大的是Ca2+、Mg2+，研究發(fā)現(xiàn)，金屬離子對(duì)藥物的療效有重要影響，藥物與金屬離子結(jié)合，形成配合體或鰲合物，促使體內(nèi)某一離子濃度受藥物的影響增加或減少，提高藥物療效或者增加其毒性，使藥物的臨床療效發(fā)生改變[10]。其可能的原因是離子與藥物形成配合體后，藥物的脂溶性增加，更易于透過細(xì)胞膜，有些藥物進(jìn)入人體內(nèi)之后，必須與金屬離子配位，改變與其結(jié)合的原生物配體的生物功能，才能更好地發(fā)揮藥效。但在植物有效成分的提取研究中，尚未見關(guān)于重金屬離子對(duì)植物提取物及其生物活性影響的報(bào)道。本研究考察了自然界水中含量最多的Ca2+、Mg2+對(duì)苦丁茶總黃酮提取和抑菌活性的影響。通過單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面法優(yōu)化出引入Ca2+、Mg2+的最佳苦丁茶總黃酮提取工藝，得到引入Ca2+、Mg2+的苦丁茶總黃酮提取物，通過抑菌試驗(yàn)，得出Ca2+、Mg2+對(duì)苦丁茶總黃酮提取物抑菌活性的影響，為研究硬水中常見Ca2+、Mg2+對(duì)植物資源開發(fā)利用的影響提供新的思路和建立理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

苦丁茶購自四川峨眉山，經(jīng)鑒定品種為冬青科冬青屬苦丁茶干葉。

1.2 試劑與儀器

無水乙醇（AR，利安隆博華醫(yī)藥化學(xué)有限公司），NaNO3、Al(NO3)3、MgCl2、NaOH、CaCl2（AR，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司），蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（純度95%，中國藥品生物制品研究所），MH 培養(yǎng)基（BR，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司），紅四氮唑（AR，天津志遠(yuǎn)科技有限公司），金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌（受贈(zèng)于西北大學(xué)化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院）。

UV-225 紫外分光光度計(jì)（大連市儀器制造公司）、MLS-3780 高壓蒸汽滅菌鍋（上海鼎謙生物科技有限公司）、ZD-85 恒溫振蕩器（常州智博瑞儀器制造有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 樣品中總黃酮提取率的測定

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制方法見文獻(xiàn)[10]，0、0.0040、0.0080、0.0120、0.0161、0.0200、0.0241 mg·mL-1的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液，放置15 min 后，在510 nm波長處分別測定吸光度（A）。以橫坐標(biāo)X 為不同質(zhì)量濃度的蘆丁標(biāo)品溶液，縱坐標(biāo)Y 為溶液對(duì)應(yīng)的吸光度值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

取1 mL 提取液加入到25 mL 容量瓶，后續(xù)同文獻(xiàn)[10]，測定藥液的吸光度值，計(jì)算苦丁茶總黃酮提取率：

式中，Y 為苦丁茶總黃酮的提取率（%），C 為苦丁茶提取液質(zhì)量濃度（mg·mL-1），N 為提取稀釋倍數(shù)，V 為提取液體積（mL），W 為提取藥材的質(zhì)量（mg）。

1.3.2 單因素試驗(yàn)

將苦丁茶粉末1.00 g 加入100 mL 單口圓底燒瓶，提取溶劑30 mL，提取溫度60 ℃，料液比1:30，乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，提取時(shí)間2 h，Mg2+濃度200 mg·L-1，Ca2+濃度為 200 mg·L-1為基礎(chǔ)提取條件。將 Ca2+濃度分別調(diào)整為 125、150、175、200、225 mg·L-1，測試 Ca2+濃度對(duì)苦丁茶總黃酮提取率的影響； 將 Mg2+濃度分別調(diào)整為 125、150、175、200、225 mg·L-1，測試 Mg2+濃度對(duì)苦丁茶總黃酮提取率的影響；將乙醇體積分?jǐn)?shù)分別調(diào)整為40%、50%、60%、70%、80%，測試乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)苦丁茶總黃酮提取率的影響；將提取時(shí)間分別調(diào)整為 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h，測試提取時(shí)間對(duì)苦丁茶總黃酮提取率的影響；將料液比分別調(diào)整為 1:10、1:20、1:30、1:40、1:50，考察料液比對(duì)苦丁茶總黃酮提取率的影響。

1.3.3 苦丁茶總黃酮的抑菌活性

MH 培養(yǎng)基的制備[11]，菌種活化[12]、菌懸液的配制參考文獻(xiàn)[13]。采用微量二倍稀釋法[14]，得到提取過程中引入Ca2+、Mg2+的提取物溶液的稀釋液，各孔總黃酮濃度分別為 97.44、48.72、24.36、12.18、6.09、3.05、1.52、0.76、0.38、0.19、0.10 mg·mL-1，對(duì)照品1 為不引入Ca2+、Mg2+的苦丁茶總黃酮提取物稀釋液，各孔總黃酮濃度分別為114.08、57.04、28.52、14.26、7.13、3.57、1.78、0.89、0.45、0.22、0.11 mg·mL-1。對(duì)照品 2 為傳統(tǒng)苦丁茶總黃酮提取物溶液中加入Ca2+、Mg2+后的稀釋液，對(duì)應(yīng)孔中總黃酮濃度與對(duì)照品1 各濃度相同。提取液、對(duì)照品 2、對(duì)照品 3 中 Ca2+、Mg2+濃度一致，第一孔濃度中分別為 181、180 mg·L-1。對(duì)照品 3 為 Ca2+溶液（第一孔中濃度 181 mg·L-1），對(duì)照品 4 為 Mg2+溶液（第一孔中濃度 180 mg·L-1），對(duì)照品 5 為 Ca2+、Mg2+溶液（濃度分別為 181、180 mg·L-1）。在上述各濃度藥液和對(duì)照品中依次加入100 μL 的三種菌液，無菌、恒溫37 ℃條件下放置24 h，觀察96孔板顏色，得到最小抑菌濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

通過Origin 模擬出總黃酮的線性回歸方程為 Y=9.9418X+0.0026（R2=0.9964）。分別將各因素水平提取液的吸光度值帶入式(1)，即可得與之對(duì)應(yīng)總黃酮提取率。如圖1 所示，隨著Ca2+濃度增大，苦丁茶總黃酮的提取率不斷增大，當(dāng)Ca2+濃度升高到175 mg·L-1時(shí)，黃酮提取率達(dá)到最大值9.74%，隨后出現(xiàn)下降趨勢，根據(jù)提取率高低，取Ca2+濃度為 150、175、200 mg·L-1三個(gè)水平進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化；Mg2+濃度對(duì)提取的影響與Ca2+濃度相似，當(dāng) Mg2+濃度升高到 175 mg·L-1時(shí)，黃酮提取率達(dá)到最大值9.97%，根據(jù)提取率高低，選取Mg2+濃度為150、175、200mg·L-1的三個(gè)水平進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化；乙醇體積分?jǐn)?shù)在40%～60%時(shí)，與苦丁茶總黃酮的提取率成正相關(guān)，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)增大到60%時(shí)，黃酮提取率達(dá)到最大值9.70%，根據(jù)提取率的高低，選擇50%、60%、70%的乙醇體積分?jǐn)?shù)三個(gè)水平進(jìn)行響應(yīng)面分析； 提取時(shí)間在1 h 時(shí)，提取率達(dá)到最大值9.80%，隨后小幅下降，但其總體趨勢平穩(wěn)，故不做響應(yīng)面分析，選用1 h 作為提取時(shí)間；在測試范圍內(nèi)，料液比與提取率呈現(xiàn)先升后降的趨勢，料液比是1:30 時(shí)提取率達(dá)到最大值9.69%，根據(jù)總黃酮提取率的高低，選取料液比為1:20、1:30、1:40 三個(gè)水平進(jìn)行響應(yīng)面分析。

圖1 單因素對(duì)苦丁茶總黃酮的提取的影響

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

單因素試驗(yàn)確定苦丁茶總黃酮提取工藝影響最大的因素水平，如表1 所示。利用Design-Expert 8.0.6 Trial 軟件中Box-Benhnken 方法設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)。得出引入Ca2+、Mg2+的苦丁茶總黃酮提取物的最佳提取工藝。

表1 苦丁茶總黃酮提取的響應(yīng)面因素與水平表

利用Box-Benhnken 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，以苦丁茶總黃酮提取率（Y）為響應(yīng)值，結(jié)果見表2。

經(jīng)軟件模擬得到回歸方程為：Y=10.02+0.109A＋0.024B－0.033C＋0.032D＋0.0580AB－0.07AC－0.015AD－0.098BC－0.22BD＋0.188CD－0.319A2－0.226B2－ 0.13C2－0.491D2

方差分析見表3，P<0.05 表示所建立模型具有高度的顯著性。模型的決定系數(shù)R2=0.94，說明因變量與全體自變量之間的多元回歸關(guān)系顯著，回歸方程很好地模擬真實(shí)曲面，實(shí)驗(yàn)可靠；R2Adj=0.88，說明該模型能解釋88%實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的變異性，擬合程度高，誤差小。失擬項(xiàng)P=0.0501，不顯著，說明該模型與實(shí)際實(shí)驗(yàn)擬合度良好，可用于苦丁黃酮提取的分析和預(yù)測。各因素標(biāo)準(zhǔn)回歸系數(shù)大小順序?yàn)锳>C>D>B，對(duì)苦丁茶中黃酮提取率的影響大小順序?yàn)镃a2+濃度>乙醇體積分?jǐn)?shù)>料液比>Mg2+濃度。

2.2.2 苦丁茶總黃酮提取的響應(yīng)面交互作用分析

如圖2 所示，各因素交互作用下苦丁茶總黃酮得率的響應(yīng)曲面可以很直觀地反映出各因素對(duì)苦丁茶總黃酮提取率的影響。乙醇濃度、料液比、Ca2+濃度、Mg2+濃度在測試范圍內(nèi)具有相互影響和作用。響應(yīng)面曲面斜率越大說明對(duì)應(yīng)的因素對(duì)提取影響顯著，綜合觀察，Ca2+離子對(duì)苦丁茶總黃酮提取影響最大，與回歸方程中的系數(shù)所表示的結(jié)果一致。

表2 苦丁茶總黃酮提取響應(yīng)面試驗(yàn)方案及結(jié)果

模型模擬得出苦丁茶總黃酮提取的最佳提取工藝條件為 Ca2+濃度為 180.58 mg·L-1、Mg2+濃度為179.56 mg·L-1、乙醇體積分?jǐn)?shù)為56.94%、料液比（g：mL）為 1:29.30、提取 1 h，預(yù)測苦丁茶總黃酮提取率為10.04%。

2.3 驗(yàn)證性試驗(yàn)

為了便利操作將模擬工藝調(diào)整為Ca2+濃度為181 mg·L-1、Mg2+濃度為 180 mg·L-1、 乙醇體積分?jǐn)?shù)為57%、料液比（g：mL）為1:29、提取為1 h，重復(fù)測試三次，苦丁茶總黃酮提取率分別為10.16%、10.12%、10.13%，平均值為10.14%，RSD=0.2054，表明提取工藝穩(wěn)定可靠，試驗(yàn)結(jié)果與模型模擬值相近，傳統(tǒng)苦丁茶中總黃酮的得率為9.25%，可見，在提取中引入Ca2+與Mg2+能有效提高苦丁茶總黃酮的提取率。

表3 苦丁茶總黃酮提取的方差分析

2.4 苦丁茶中總黃酮的抑菌活性

由表4 所示，提取液對(duì)三種菌（大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌）最小抑菌濃度分別為 12.18、6.09、12.18 mg·mL-1，未引入 Ca2+、Mg2+提取液的最小抑菌濃度分別為14.26、28.52、28.52 mg·mL-1，單獨(dú)的 Ca2+溶液、Mg2+溶液或 Ca2+與Mg2+溶液混合液對(duì)三種菌均沒有抑菌作用?？梢娨隒a2+、Mg2+后能顯著提升苦丁茶總黃酮抑菌活性，而傳統(tǒng)苦丁茶總黃酮提取物溶液中后補(bǔ)加入Ca2+、Mg2+則對(duì)抑菌活性影響不大，Ca2+溶液、Mg2+溶液或者Ca2+和Mg2+溶液無抑菌活性?？赏茰y，提取過程引入Ca2+和Mg2+與苦丁茶總黃酮化合物可能生成某種具有較強(qiáng)抑菌活性的配合物，且反應(yīng)條件與苦丁茶總黃酮的提取過程相似，而補(bǔ)加Ca2+、Mg2+由于沒有參與提取過程，缺少相應(yīng)反應(yīng)的條件，未形成較強(qiáng)抑菌活性的配合物。因此，提取過程中引入Ca2+和Mg2+有助于提升苦丁茶總黃酮的抑菌活性。

3 討論與結(jié)論

本文考察了Ca2+和Mg2+對(duì)苦丁茶的提取和抑菌生物活性的影響。通過單因素試驗(yàn)，篩選出對(duì)苦丁茶總黃酮影響最顯著的因素水平，采用響應(yīng)面分析中Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化出苦丁茶總黃酮提取最優(yōu)工藝，即Ca2+濃度181mg·L-1、Mg2+濃度 180 mg·L-1、 乙醇濃度 57%、 料液比（g:mL）為 1:29，提取時(shí)間為 1 h。經(jīng)驗(yàn)證，該工藝的提取率平均值為10.14%，與傳統(tǒng)的提取工藝比較提取率有小幅度的提升。測試了在提取過程中引入Ca2+、Mg2+提取液的抑菌效果，結(jié)果表明： 在苦丁茶總黃酮的提取過程中引入Ca2+、Mg2+后能顯著提升其抑菌活性，對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的MIC值為 14.26、28.52、28.52 mg·mL-1，明顯低于對(duì)照組。

該工藝為苦丁茶的提取提供了更多的選擇，使得苦丁茶總黃酮的提取成本得到降低，提取溶劑由“蒸餾水+乙醇”延伸為“自來水+乙醇”。同時(shí)，提取物對(duì)本研究中三種測試菌的最小抑菌濃度有較為明顯的降低，可推測在提取過程中溶液中的Ca2+和Mg2+能與苦丁茶總黃酮化合物形成某種具有較強(qiáng)抑菌活性的配合物，因此，在苦丁茶總黃酮開發(fā)和利用過程中應(yīng)該充分考慮并利用金屬離子對(duì)其活性的影響。本研究為中藥發(fā)展提供了新的思路，為研究離子對(duì)中藥藥效重要作用開辟了理論基礎(chǔ)。

圖2 各因素對(duì)苦丁茶總黃酮提取率影響的響應(yīng)面圖

表4 苦丁茶中總黃酮的最小抑菌濃度（MIC）