楊 璨，王 輝

（重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院婦產科，重慶 400016）

卵巢癌作為女性生殖道腫瘤病死率最高的惡性腫瘤［1］，臨床早期診斷困難，發(fā)現(xiàn)時多為晚期，預后差，治療方案以切除既有癌組織輔以鉑類、紫杉醇為基礎的化學治療（化療）為主，以此延長患者的總生存期（OS）及無進展生存期（PFS）［2］?，F(xiàn)今多樣化的治療方案輔以抗腫瘤血管生成藥物（如貝伐單抗）、聚腺苷酸二磷酸核糖基聚合酶（PARP）抑制劑（如奧拉帕尼）［3 -4］等的臨床使用，雖不同程度延長了患者的PFS，但術后殘留的病灶或肉眼無法識別的微小病灶依舊是影響預后的重要因素［5］。目前的手段主要是通過腫瘤標志物或影像學的檢測對卵巢癌患者進行隨訪，而對某些腫瘤標志物陰性的患者，僅可通過影像學的評估變化其狀態(tài)，缺乏早期診斷、療效評估及預后評估的有效手段。循環(huán)腫瘤細胞（CTCs）檢測因具有采用血樣標本的可操作性、可重復性及前瞻性的優(yōu)勢，成為卵巢癌臨床監(jiān)測必備手段。

1 CTCs

1.1 定義

CTCs 是由自發(fā)或診療操作，源于實體腫瘤原發(fā)灶或轉移灶，且只有少數(shù)具有高活性的CTCs 可逃離機體的免疫損傷而存活，并通過血液運行轉移到其他組織器官中形成轉移灶的稀有細胞［6］。自1869 年首次報道在1 例轉移性癌癥患者的血液中觀察到CTCs 開始［7］，再到1889 年的“種子土壤學說”—— 腫瘤微環(huán)境提供腫瘤增殖及侵襲的相關分子，如細胞因子、生長因子等可促進細胞遷移，經過數(shù)百年時間，CTCs 的臨床價值和研究潛力正被逐漸顯現(xiàn)。近20 年PubMed 上相關發(fā)文情況見圖1。

圖1 PubMed 近20 年發(fā)表關于CTCs 的文章量

1.2 轉移

腫瘤患者生存期短的原因主要是腫瘤的復發(fā)轉移，但轉移擴散的機制還遠未闡明。最近有研究表明，腫瘤轉移存在以下2 種模式。

1）傳統(tǒng)的模型是單個腫瘤細胞依賴上皮間質轉化（EMT），即原發(fā)腫瘤的上皮細胞獲得脫離原發(fā)灶浸潤周圍組織進入血液的能力，進入血液形成CTCs，逃逸機體免疫，適應新的腫瘤微環(huán)境，在患者其他組織器官間質上皮轉化（MET）形成新的轉移灶［8］。原發(fā)腫瘤以EMT 形式進行轉移，CTCs 在血液中以上皮型、混合型、間質型3 種形式存在。且相關研究表明，若在血液中發(fā)現(xiàn)較多混合型或間質性CTCs，表明患者轉移復發(fā)的風險增大［9］。

2）原發(fā)腫瘤以鏈、團或聚集成循環(huán)腫瘤細胞簇的形式浸入周圍組織，并向受損血管內灌注，CTCs 簇吸引血細胞形成微血栓，與單個CTCs 相比存活率更高、外滲速度更快、侵襲性更強［10］。LEE 等［11］在一項納入24 例原發(fā)性卵巢癌和30 例復發(fā)患者的前瞻性研究中發(fā)現(xiàn)，在復發(fā)患者和耐藥患者血液中能找到更多的CTCs 簇，提示其與總體生存率呈負相關。無論腫瘤細胞通過何種方式進行轉移，患者血液中的CTCs 被視為最主要的潛在轉移因素之一，監(jiān)測不同類型的CTCs 更利于準確判斷預后、有效診斷及制訂更實用的治療方案。

1.3 檢測

1 mL 血液中含有數(shù)十億個細胞，而CTCs 非常罕見，僅占白細胞總數(shù)的1/（106～107），如何克服其數(shù)量少帶來的技術限制是目前集中研究的問題。CTCs 的檢測一般通過富集和鑒定2 個步驟進行檢測。

富集：由于CTCs 的稀缺性，必須在被發(fā)現(xiàn)前進行富集，目前所有技術主要依賴細胞的生物學特性及其固有物理特性。

1）依賴細胞生物學特性的富集技術，利用特定標志物，這些標志物由腫瘤細胞表達但血細胞不表達［如上皮細胞黏附分子（EpCAM）］及由血細胞表達但CTCs 不表達（如CD45），再以磁珠與相應抗體結合，利用其復合物的磁性進行富集［12］。目前臨床最常用的是被美國食品和藥物管理局（FDA）批準的依賴EpCAM 抗體的Cellsearch 檢測系統(tǒng)，利用免疫磁珠對7.5 mL 外周血中的CTCs 進行富集［13-14］，多用于評估晚期轉移性乳腺癌、結直腸癌、前列腺癌等的預后，但VAN BERCKELAER 等［15］指出，在卵巢上皮癌中依賴EpCAM 的富集方式得到的結果欠佳，其原因可能為卵巢上皮癌中EpCAM 陽性的CTCs 較少及EpCAM 在EMT 過程中減少。故在此基礎上，為了彌補Cellsearch 只能識別表達EpCAM 腫瘤的缺陷，新技術利用的抗體不僅能識別上皮腫瘤標志物EpCAM 和細胞角蛋白（CK）7/8/18/19、白細胞標志物CD45，還能篩選間質腫瘤標記物波形蛋白（Vimentin）和Twist 蛋 白［16］，從 而 有 效 富 集 各 類CTCs。

2）依賴細胞固有物理特性的富集技術，可幫助CTCs 與血液中的正常細胞（如白細胞、內皮細胞、造血干細胞）區(qū)分開而無須生物標記。在這些物理特性主要集中在CTCs 和血細胞特性的差異上，主要是細胞大小、細胞可變性及電學性上，如利用上皮腫瘤細胞比外周血細胞大的膜過濾法（ISET），能迅速在不破壞細胞形態(tài)的前提下分離CTCs［16］；還有利用細胞密度梯度進行分離的方法，但試驗溫度及操作時間控制不當會使細胞受到破壞而降低其純度。

鑒定：CTCs 被富集后需再次鑒定，依賴其本身抗原及腫瘤遺傳特異性，主要采用免疫細胞化學（ICC）及逆轉錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）2 種檢測方法［17］。ICC 是利用熒光抗體與腫瘤標記物特異性結合的技術，具有較高敏感性，再聯(lián)合流式分析技術，即利用ICC 標記的熒光信號，對CTCs 實現(xiàn)快速高效分選及定量分析；RTPCR 主要是發(fā)現(xiàn)血液中腫瘤表達的相關mRNA，然后將mRNA 鏈逆轉錄成cDNA，通過PCR 擴增多個相關腫瘤標志物，分析其表達模式［18］。

2 卵巢癌的臨床診斷

卵巢癌由于發(fā)現(xiàn)晚、診斷困難影響了患者的有效治療時機，故目前臨床急需發(fā)現(xiàn)早期診斷卵巢癌的有效方法。

ZHANG 等［19］采用免疫磁珠法對109 例卵巢癌患者測定CTCs，并對其中51 例患者同時檢測CTCs 及糖蛋白125（CA125），發(fā)現(xiàn)90.00%的初診患者檢測出CTCs，且CTCs 的數(shù)量與分期相關（P＝0.034），ⅠA ～ⅠB 期患者CTCs 的陽性率為92.16% ，遠高于同一患者CA125 的陽性率（64.47%），提示CTCs 檢測較CA125可早期診斷卵巢癌。

PEARL 等［20］利用功能性富集法收集術前疑似卵巢上皮癌的129 例患者CTCs，將其中58 例良性、Ⅰ、Ⅱ期疾病患者進行對比，發(fā)現(xiàn)CTCs 檢測在Ⅰ、Ⅱ期敏感性為40.85% ，特 異 性 為95.10% ，陽 性 預 測 值（PPV）為77.80%，然而CA125 特異性僅為76.20%，再次提示CTCs 可作為卵巢癌早期診斷指標之一。

SUH 等［21］前瞻性收集術前未明確附件包塊性質的87 例患者血清腫瘤標志物CA125、ROMA 值、CT 或MRI 及CTCs，發(fā)現(xiàn)在早期癌癥中CTCs 檢測較其他檢測方式敏感性更高，提示CTCs 對術前附件包塊的良惡性鑒別具有重要意義。

RIED 等［22］以ISET 法收集癌癥患者及有高危因素的但無癥狀患者的CTCs，發(fā)現(xiàn)所有癌癥患者和半數(shù)篩查無癥狀患者均檢測到CTCs，在CTCs 呈陽性的10 個月內，20%的篩查患者中發(fā)現(xiàn)了早期癌癥病變，提示利用CTCs 進行篩查可升高附件惡性腫瘤早期發(fā)現(xiàn)率。

3 卵巢癌的療效評估及指導個體化用藥

丁凌雁等［23］利用流式細胞儀收集60 例晚期卵巢癌（Ⅲ～Ⅳ期）患者化療2 周期前后CTCs，研究結果顯示，化療后患者CTCs 減少，且提示CTCs 減少的患者較外周血CTCs 計數(shù)≥5 的患者平均PFS 延長約6 個月（13.2 個月比6.4 個月），提示CTCs 與患者化療療效及預后有關。

目前，卵巢癌一線化療方案以鉑類為主，鉑類藥物主要作用于腫瘤細胞DNA，引起腫瘤細胞DNA 復制障礙，從而抑制其分裂，機體由此開始反應，細胞內核酸切除修復系統(tǒng)開始修復鉑類藥物對細胞造成的損傷，其中最主要的基因為切除修復交叉互補組1（ERCC1）基因［24］。

CHEBOUTI 等［25］采用單鏈RT-PCR 對ERCC1 進行分離，發(fā)現(xiàn)以鉑類為基礎化療的卵巢癌可能導致ERCC1 基因陽性的CTCs 增加，修復鉑類藥物對癌癥細胞造成的損害，從而削弱鉑類化療療效，提示ERCC1 基因可作為診斷卵巢癌耐藥基因之一。

OBERMAYR 等［26］還在對比卵巢癌患者外周血樣本時發(fā)現(xiàn)，化療后鉑耐藥的患者比鉑敏感的患者更能檢測到親環(huán)素C（PPIC）陽性的CTCs，提示PPIC 可能與卵巢癌患者鉑耐藥有關。

CHEBOUTI 等［27］檢測91 例卵巢癌患者術前及化療后CTCs，發(fā)現(xiàn)以鉑類為基礎化療的卵巢癌患者出現(xiàn)EMT-CTC 聚集，并引起CTCs 的分子表型向間質表型（如Twist，PI3Kα，Akt-2）轉化，提示腫瘤可能向鉑耐藥方向發(fā)展。

CTCs 不僅能作為評估卵巢癌患者化療的參考指標，還提供對化療可能產生反應的相應特殊基因，為及時更換化療方案提供可監(jiān)測的手段。

4 卵巢癌預后

POVEDA 等［28］通過Cellsearch 系統(tǒng)納入216 例復發(fā)的晚期卵巢癌患者CTCs，并囊括CA125、鉑敏感性、腫瘤最大直徑等多因素分析，發(fā)現(xiàn)CTCs 多患者較CTCs陰性患者的病情進展及死亡風險高（分別為1.58 及1.54 倍），提示CTCs 數(shù)量與預后呈反相關。

董小麗等［29］收集31 例術后將行周期化療的卵巢上皮癌患者，在術后化療開始前、3 次化療后1 周內、6 次化療后1 周內收集CTCs，發(fā)現(xiàn)隨著化療的逐步進行，CTCs 整體呈下降趨勢，12 例完成6 個月隨訪的患者中4 例復發(fā)，CTCs 陽性且以間質型和混合型CTCs 為主，表明化療后仍能檢測出CTCs 的卵巢癌患者，復發(fā)轉移概率越高，預后越差。

ZHOU 等［30］在Meta 分析中匯集11 篇文獻，囊括1 129 例卵巢癌患者，指出與CTCs 陰性組相比，CTCs陽性組患者的OS、PFS 及無病生存期（DFS）更短，且指出CTCs 的存在與血清腫瘤標志物CA125 的增加有關，再次提示CTCs 可作為監(jiān)測卵巢癌預后的指標之一。

5 結語

CTCs 的優(yōu)勢主要基于其獨特的潛力提供了“液體活檢”樣本，易得到疾病在多個時間點的樣本信息，可用于評估早期療效，幫助建立個性化的治療方法，提高療效減少成本。CTCs 在DNA 和RNA 及所表達的特征蛋白質水平均可作為“液體活檢”方法。有研究分析ctDNA與腫瘤活檢中發(fā)現(xiàn)的突變和表觀遺傳變化具有一致性，且可能較CTCs 對治療期間的微小殘留灶有更高的敏感性［31-32］。在美國國立衛(wèi)生研究院（NIH）官方網(wǎng) 站（https：/ /clinicaltrials.gov/ct2/home）分 別 以“Circulating Tumor Cells”“Circulating Tumor DNA”為關鍵詞進行搜索（2020 年1 月15 日），顯示有860 篇及405 篇臨床研究正在進行。在尋找各個類型癌癥時，發(fā)現(xiàn)了系列評估CTCs 和ctDNA 作為“液體活檢”作用的臨床研究（見圖2），雖然這些研究采取不同方式、不同人群、不同標準進行，但仍可能成為推進“液體活檢”作為新一代腫瘤標志物檢查的證據(jù)。

圖2 NIH 官方網(wǎng)站基于CTCs 和ctDNA 所獲得的各類腫瘤臨床研究

目前，CTCs 的臨床意義已在多種類型實體腫瘤中得到有效評價，盡管其檢測正逐步應用于臨床，但還存在以下不足：1）目前找尋外周血CTCs 的方式有限，尚無統(tǒng)一檢測標準；2）檢查費用高昂，經濟實用性欠佳；3）多數(shù)研究無法證明CTCs 在外周血釋放規(guī)律，且無大數(shù)據(jù)隨訪患者相關生存期及療效。上述原因可能會影響CTCs 檢測在臨床的廣泛應用。但通過CTCs 檢測的不斷探索、更新及大樣本數(shù)據(jù)臨床試驗的逐步開展，若能統(tǒng)一CTCs 相關抗原標記物，增加其敏感性及特異性，逐步降低檢測費用，CTCs 檢測在卵巢惡性腫瘤中的臨床使用前景及實用價值將得到進一步提升。