唐源淋 陳 燁

深圳市第三人民醫(yī)院消化內(nèi)科1(518114) 南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院消化科 廣東省胃腸疾病重點(diǎn)實驗室2

背景：全球約半數(shù)人群存在幽門螺桿菌(Hp)感染，根除Hp是治療其感染相關(guān)疾病的重要方法。目的：分析Hp根除前后部分腸道菌群的改變，探討鉍劑四聯(lián)療法對腸道微生態(tài)的影響。方法：納入2016年1月—2017年1月在深圳市第三人民醫(yī)院發(fā)現(xiàn)Hp感染陽性、接受鉍劑四聯(lián)療法根除治療并成功根除Hp的個體，采集其Hp根除前和根除治療結(jié)束后3 d內(nèi)的糞便標(biāo)本，提取基因組DNA，采用菌屬特異性引物行real-time PCR定量分析。結(jié)果：與根除前相比，Hp根除后糞便腸桿菌屬、腸球菌屬數(shù)量明顯增加，雙歧桿菌屬、擬桿菌屬、梭菌屬和總菌數(shù)量明顯減少，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，乳酸桿菌屬數(shù)量無明顯變化(P>0.05)。結(jié)論：采用鉍劑四聯(lián)療法根除Hp可影響腸道菌群結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致腸道微生態(tài)失衡。

幽門螺桿菌(Helicobacterpylori, Hp)感染與慢性胃炎、消化性潰瘍、胃癌和胃黏膜相關(guān)淋巴樣組織(MALT)淋巴瘤的關(guān)系已得到公認(rèn)[1]。全球約半數(shù)人群存在Hp感染，根除Hp是治療其感染相關(guān)疾病的重要方法。目前國、內(nèi)外Hp感染處理共識均推薦使用由質(zhì)子泵抑制劑(PPI)、鉍劑聯(lián)合兩種抗菌藥物組成的四聯(lián)方案根除Hp[2-3]。既往研究發(fā)現(xiàn)Hp感染對胃內(nèi)正常菌群結(jié)構(gòu)有顯著影響[4]，關(guān)于Hp根除治療對腸道微生態(tài)的影響，現(xiàn)有研究結(jié)果不一。本研究通過分析Hp根除前后部分腸道菌群的改變，探討鉍劑四聯(lián)療法對腸道微生態(tài)的影響。

對象與方法

一、研究對象

納入2016年1月—2017年1月在深圳市第三人民醫(yī)院體檢中心發(fā)現(xiàn)Hp感染陽性、首次接受Hp根除治療并成功根除Hp的個體，采集其Hp根除前后的糞便標(biāo)本進(jìn)行定量分析。采集體檢中心同期健康體檢者的糞便標(biāo)本用于引物特異性檢測。納入標(biāo)準(zhǔn)：①入組前14C-尿素呼氣試驗(14C-UBT)結(jié)果陽性(DOB≥100)，治療結(jié)束后4周復(fù)查14C-UBT結(jié)果陰性(DOB<100)；②既往未接受過Hp根除治療；③臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并嚴(yán)重心、腦、肺、腎等器官功能不全；②合并慢性腹瀉、炎癥性腸病等已知可引起腸道菌群紊亂的疾病；③胃腸道手術(shù)史；④進(jìn)入試驗前4周應(yīng)用PPI、抗菌藥物和(或)微生態(tài)制劑。研究方案經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審核、批準(zhǔn)，研究對象均簽署知情同意書。

二、方法

1. Hp根除治療：采用鉍劑四聯(lián)療法行Hp根除治療：艾司奧美拉唑鎂腸溶片20 mg口服，2次/d+膠體果膠鉍膠囊200 mg口服，2次/d+阿莫西林膠囊1 000 mg口服，2次/d+克拉霉素緩釋片0.5 g口服，2次/d，療程14 d。根除治療過程中記錄藥物相關(guān)不良反應(yīng)發(fā)生情況。治療結(jié)束后4周復(fù)查14C-UBT。

2. 糞便標(biāo)本采集：Hp根除前和根除治療結(jié)束后3 d內(nèi)，于排便后2 h內(nèi)收集糞便標(biāo)本并儲存于密閉儲存盒內(nèi)，迅速置入-80 ℃低溫冰箱中保存。

3. 糞便基因組提?。好坷S便樣本稱取200 mg，使用TIANamp糞便DNA提取試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司]，按試劑盒說明書操作提取基因組DNA，-20 ℃保存。

4. PCR引物設(shè)計：根據(jù)文獻(xiàn)報道設(shè)計腸桿菌屬、腸球菌屬、雙歧桿菌屬、乳酸桿菌屬、擬桿菌屬、梭菌屬的菌屬特異性引物[5-6]和總菌引物[7]，并在BLAST數(shù)據(jù)庫(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)內(nèi)比對引物序列的特異性(表1)。

5. PCR引物特異性檢測：提取健康體檢者糞便基因組DNA，行常規(guī)PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系總體積25 μL：Premix Taq 12.5 μL，上、下游引物各1 μL，DNA模板1 μL，ddH2O 9.5 μL。反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，退火30 s(溫度見表1)，72 ℃ 1 min，共30個循環(huán)；72 ℃ 10 min。1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，結(jié)果顯示電泳圖中除目的條帶外未見明顯非特異性擴(kuò)增，提示引物特異性好，可用于real-time PCR。

6. Real-time PCR：試劑盒為天根生化科技(北京)有限公司產(chǎn)品。將質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品連續(xù)10倍稀釋，獲得10～107系列拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品，以之為模板構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線。反應(yīng)體系總體積20 μL：SYBR Green Master Mix 10 μL，上、下游引物各1 μL，DNA模板5 μL，ddH2O 3 μL。反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 10 s，退火20 s(溫度分別為腸桿菌屬58 ℃，腸球菌屬52 ℃，雙歧桿菌屬57 ℃，乳酸桿菌屬58 ℃，擬桿菌屬60 ℃，梭菌屬60 ℃，總菌60 ℃)，72 ℃ 30 s，共45個循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行熔解曲線分析。將待測糞便DNA適當(dāng)稀釋后，反應(yīng)體系和條件同上，行real-time PCR。檢測重復(fù)3次，結(jié)果取均值。

三、統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計學(xué)軟件，計量資料以M(P25,P75)表示，兩組間比較采用兩獨(dú)立樣本非參數(shù)檢驗中的Mann-Whitney U檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

表1 PCR菌屬特異性引物和總菌通用引物信息

結(jié) 果

一、一般情況

共50例成功根除Hp并符合篩選標(biāo)準(zhǔn)的患者納入研究，其中男性30例，女性20例，平均年齡(30±10)歲。根除治療過程中5例(10.0%)患者出現(xiàn)惡心，7例(14.0%)出現(xiàn)腹脹，15例(30.0%)出現(xiàn)腹瀉，5例(10.0%)出現(xiàn)便秘，少數(shù)患者同時有上述2～3項癥狀。

二、Hp根除前后主要腸道菌群改變

Real-time PCR檢測顯示，與根除前相比，Hp根除后糞便腸桿菌屬、腸球菌屬數(shù)量明顯增加，雙歧桿菌屬、擬桿菌屬、梭菌屬數(shù)量明顯減少，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，乳酸桿菌屬數(shù)量無明顯變化(P>0.05)，總菌數(shù)量明顯減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05；表2、圖1)。

討 論

Hp于1983年首次從胃黏膜中被成功分離，其可在強(qiáng)酸性環(huán)境下穩(wěn)定定植，通過產(chǎn)生CagA、VacA等細(xì)胞毒素以及代謝產(chǎn)物的直接破壞作用和介導(dǎo)炎性反應(yīng)，導(dǎo)致胃黏膜持續(xù)性損害，與慢性胃炎、消化性潰瘍、胃癌和胃MALT淋巴瘤的發(fā)病密切相關(guān)。隨著對Hp研究的日益深入，越來越多的胃腸外疾病，如特發(fā)性血小板減少性紫癜、不明原因缺鐵性貧血等亦被發(fā)現(xiàn)與Hp感染相關(guān)[2-3]。我國人群Hp感染率在50%以上，根除Hp是治療其感染相關(guān)疾病的重要方法，可修復(fù)胃黏膜，促進(jìn)潰瘍愈合，降低潰瘍復(fù)發(fā)和胃癌發(fā)生風(fēng)險。國、內(nèi)外Hp感染處理共識均推薦使用由PPI、鉍劑聯(lián)合兩種抗菌藥物組成的四聯(lián)療法根除Hp，療程為10 d或14 d[2-3]。

表2 Hp根除前后主要腸道菌群改變(M, lg copies/g糞便)

腸道內(nèi)細(xì)菌是一個巨大的微生態(tài)平衡系統(tǒng)，其平衡依賴于各種菌群種類、數(shù)量、定居部位等多方面的平衡，菌群之間相互協(xié)調(diào)、相互制約，共同構(gòu)成整體平衡的微生態(tài)系統(tǒng)。既往研究顯示，抗菌藥物的不當(dāng)使用可引起腸道菌群失調(diào)，影響程度取決于藥物的抗菌譜及其劑量、給藥途徑、使用時間、腸道內(nèi)藥物濃度等[8-11]。Barc等[12]應(yīng)用含人類糞便中主要菌群的小鼠模型研究阿莫西林克拉維酸對腸道微生態(tài)的影響，結(jié)果顯示用藥后腸桿菌屬和普氏菌屬數(shù)量顯著增加，優(yōu)桿菌屬和梭菌屬數(shù)量顯著減少。另一項應(yīng)用高通量技術(shù)分析抗菌藥物對成人腸道菌群結(jié)構(gòu)影響的研究[10]顯示，大劑量抗菌藥物可顯著改變擬桿菌、雙歧桿菌、梭菌、腸桿菌和乳酸桿菌數(shù)量，不同抗菌藥物對不同菌種的影響各不相同。且抗菌藥物的濫用或不規(guī)范使用可選擇并富集耐藥菌株[13-15]，耐藥菌大量繁殖導(dǎo)致菌群比例發(fā)生變化，造成腸道微生態(tài)失衡。因此，規(guī)范、合理地使用抗菌藥物具有重要意義。

圖1 Hp根除前后主要腸道菌群改變(real-time PCR)

鉍劑四聯(lián)療法Hp根除治療方案中含有兩種抗菌藥物，藥物劑量大，療程較長，治療過程中部分患者會出現(xiàn)不同程度的惡心、嘔吐、腹脹、腹瀉、便秘、食欲不振等一系列胃腸道功能紊亂癥狀，推測根除Hp造成的胃腸道微生態(tài)環(huán)境變化可能參與了這些癥狀的發(fā)生。當(dāng)前日益升高的Hp根除失敗率以及多重耐藥的出現(xiàn)是否與根除治療所致的繼發(fā)性菌群失調(diào)存在關(guān)聯(lián)，亦有待明確。目前Hp根除治療藥物對腸道微生態(tài)的影響正逐步受到廣泛關(guān)注。本研究選取6個具有代表性的腸道菌群，通過定量分析其在鉍劑四聯(lián)療法根除Hp前后的改變，探討根除治療對腸道菌群的影響，以期為益生菌在Hp根除治療中的應(yīng)用提供臨床依據(jù)。

本組50例行鉍劑四聯(lián)療法根除治療的Hp陽性患者中，分別有5例、7例、15例和5例出現(xiàn)惡心、腹脹、腹瀉、便秘等胃腸道功能紊亂癥狀。與根除前相比，Hp根除后糞便腸桿菌屬、腸球菌屬數(shù)量顯著增加，雙歧桿菌屬、擬桿菌屬、梭菌屬和總菌數(shù)量顯著減少，乳酸桿菌屬數(shù)量則無明顯變化，證實Hp根除治療會對部分腸道菌群產(chǎn)生影響，導(dǎo)致腸道微生態(tài)失衡。國內(nèi)學(xué)者既往采用細(xì)菌培養(yǎng)技術(shù)的研究結(jié)果亦顯示Hp根除治療對腸道菌群有顯著影響[16-17]。傳統(tǒng)的糞便細(xì)菌培養(yǎng)方法存在費(fèi)時、培養(yǎng)要求高、影響因素多等問題，real-time PCR、宏基因組測序技術(shù)能較完整地保留腸道微生物的遺傳信息，結(jié)果更接近菌群的真實概況，在研究菌群中微生物特定基因的功能、代謝通路等方面具有明顯優(yōu)勢。但宏基因組測序也存在對測序片段進(jìn)行分裝的計算量大、參考數(shù)據(jù)庫不完善、算法的準(zhǔn)確性對后續(xù)菌群分析影響大、測序深度不夠時對稀有物種的敏感性不高、費(fèi)用昂貴、操作復(fù)雜等不足，難以廣泛應(yīng)用于臨床檢測。Real-time PCR則克服了宏基因組測序特征維度高、對稀有物種不敏感、生物學(xué)背景弱等缺點(diǎn)，方法簡單、易操作，敏感性和特異性高，適合在臨床實踐中開展。

Hp根除治療相關(guān)胃腸道微生態(tài)失衡可能導(dǎo)致細(xì)菌移位、細(xì)菌過度生長和腸源性感染，從而影響患者預(yù)后，因此針對菌群失調(diào)的治療顯得尤為重要。峗向東[18]的研究發(fā)現(xiàn)，雙歧桿菌活菌制劑能有效防治Hp根除治療引起的腸道菌群失調(diào)。除抗菌藥物外，Hp根除治療方案中的PPI亦對胃腸道微生態(tài)有顯著影響。肖麗君[19]的研究表明，Hp根除治療可顯著升高胃內(nèi)pH值，使機(jī)體抵御外源性病原體的天然屏障受損，導(dǎo)致胃內(nèi)細(xì)菌過度生長；聯(lián)合使用雙歧桿菌三聯(lián)活菌制劑則可減少根除治療相關(guān)的胃內(nèi)細(xì)菌生長，胃液pH值大于4時該作用尤為明顯。有研究[20]發(fā)現(xiàn)，在長期使用PPI的人群中，21%存在小腸細(xì)菌過度生長(SIBO)。對于單純SIBO病例，使用益生菌制劑即可能達(dá)到腸道去污和癥狀緩解[21]，慢性SIBO患者則應(yīng)考慮抗菌藥物利福昔明治療[22-23]。國內(nèi)賀星等[24]的研究探討了利福昔明與雙歧桿菌三聯(lián)活菌制劑序貫治療SIBO的效果，結(jié)果顯示與單純利福昔明治療相比，序貫治療可顯著提高小腸細(xì)菌轉(zhuǎn)陰率和臨床療效。楊娟等[25]采用利福昔明聯(lián)合酪酸梭菌制劑治療SIBO，亦取得良好效果。近年來，越來越多的臨床研究驗證了在傳統(tǒng)三聯(lián)或四聯(lián)療法基礎(chǔ)上加用乳酸桿菌或布拉酵母菌可提高Hp根除率，因此歐洲最新Maastricht Ⅴ共識報告建議基于已顯示的臨床效果選擇特定益生菌作為Hp根除治療的輔助用藥[2]。

綜上所述，我國人群Hp感染率高，陽性患者應(yīng)接受Hp根除治療。國、內(nèi)外共識推薦的鉍劑四聯(lián)療法可影響腸道菌群結(jié)構(gòu)，表現(xiàn)為腸桿菌屬、腸球菌屬數(shù)量增加，雙歧桿菌屬、擬桿菌屬、梭菌屬和總菌數(shù)量減少，導(dǎo)致腸道微生態(tài)失衡。然而本研究只采集了Hp根除后單一時間點(diǎn)的糞便標(biāo)本，故未能進(jìn)一步明確腸道菌群結(jié)構(gòu)隨時間推移的變化，對于不同Hp根除治療方案對腸道微生態(tài)是否具有不同影響，亦缺乏足夠的臨床證據(jù)，有待后續(xù)研究進(jìn)一步完善。目前益生菌在消化系統(tǒng)中的作用機(jī)制及其生物學(xué)特性和行為尚未完全明確，在臨床應(yīng)用方面亦存在諸多問題，如益生菌菌株的選擇、治療劑量和療程以及如何與其他藥物聯(lián)合應(yīng)用等，有待未來進(jìn)一步深入研究。