閆 振，黃健垚，王登良，2

（1.廣東德高信食品加工有限公司，廣東 英德 513000；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，廣東 廣州 510642）

嘌呤生物堿是一類含氮雜環(huán)有機(jī)化合物，茶樹中的生物堿主要有咖啡堿、可可堿、茶堿及其他黃嘌呤甲基衍生物。在Camellia sinensis茶種中，咖啡堿是生物堿的特征性成分，一般占茶葉干重的2%～4%，其次是可可堿（0.05%）和茶堿（0.002%）［1］。茶葉中的咖啡堿有提神、醒腦等功效，但過多攝入則會(huì)導(dǎo)致失眠、心悸等負(fù)面影響，而且不適合兒童、老人和孕婦等一些特殊人群［2］。而富含可可堿的茶樹因其高可可堿、低咖啡堿的特點(diǎn)從而避免了過多攝入咖啡堿對(duì)身體產(chǎn)生的負(fù)面影響而受到人們的重視。野生天然生長(zhǎng)的高可可堿茶樹種質(zhì)資源在我國境內(nèi)多地已陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)，如廣東南昆山的可可茶、福建南部山區(qū)的紅芽茶、云南馬關(guān)和西疇一帶的厚軸茶（Camellia crassicolumaChang）、廣西大瑤山的禿房茶（Camellia gymnogynaChang）等。廣東南昆山的可可茶屬于毛葉茶類（Camellia ptilophyllaChang），是20世紀(jì)80年代由植物學(xué)家張宏達(dá)教授發(fā)現(xiàn)的一種天然富含可可堿的茶樹品種資源。以可可茶鮮葉按照傳統(tǒng)加工工藝制成的茶葉與普通茶葉在風(fēng)味品質(zhì)上無明顯差別，而在保健方面卻具有突出的保護(hù)缺氧心肌、膳食抗氧化、抗炎和一定的抗腫瘤功效［3-4］。福建紅芽茶是發(fā)現(xiàn)于福建省南部地區(qū)海拔700～1 000 m之間的狹窄山區(qū)中野生富含可可堿的茶樹資源，當(dāng)?shù)厝朔Q之為“紅葉茶”并認(rèn)為飲用這種茶有減少體內(nèi)熱量、治療感冒和胃痛等藥用效果［5］。禿房茶也是一種野生茶樹資源，在我國西南多個(gè)地區(qū)均有發(fā)現(xiàn)，除了高可可堿的特點(diǎn)外，其茶葉中還富含苦茶堿，有清熱、解毒、消腫的醫(yī)療效果［6］。厚軸茶是發(fā)現(xiàn)于云南境內(nèi)的一種富含可可堿的野生茶樹資源，馬關(guān)縣區(qū)域內(nèi)90%的厚軸茶只含有可可堿，大壩大樹茶、金廠大樹茶均屬于厚軸茶，其成茶制品具有擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈、興奮心肌、松弛氣管平滑肌等作用［7-8］。這些茶種的生物堿均以可可堿為主，具有獨(dú)特的保健功效，是一類稀有的茶樹種質(zhì)資源。本文從生化成分組成特征、可可堿生物合成與分解途徑、可可堿在茶樹體內(nèi)富含的分子機(jī)理及其保健功效對(duì)上述4份茶種資源進(jìn)行比較分析與綜述，并對(duì)其資源挖掘與利用前景進(jìn)行展望。

1 天然富含可可堿茶樹的生化成分組成特征

1.1 生物堿單體組成特征

Jin等［5］、Teng等［6］以春茶一芽一葉中的生物堿為研究對(duì)象，以常規(guī)種茶樹龍井43（LJ 43）作對(duì)照，結(jié)果表明，與茶樹龍井43春茶一芽一葉中生物堿的組成特點(diǎn)不同，禿房茶（CGY）、可可茶（CCT）和紅芽茶（HYC）中的生物堿均以可可堿為主，可可堿的質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著高于咖啡堿（表1）。由表1可知，可可茶、紅芽茶和厚軸茶的葉片中均檢測(cè)不到咖啡堿，而可可茶、紅芽茶的可可堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)高達(dá)5.5%，是龍井43的近24倍；厚軸茶的可可堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)在1.9%左右，低于可可茶和紅芽茶，但也高出龍井43的8倍左右；禿房茶的生物堿組成與可可茶、紅芽茶和厚軸茶稍有差異，主要由可可堿、咖啡堿和苦茶堿組成，其生物堿以可可堿為主，質(zhì)量分?jǐn)?shù)在3.7%左右，介于紅芽茶和厚軸茶之間，而咖啡堿僅有0.188%，前者是后者近20倍。除此之外，禿房茶一芽一葉的苦茶堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)介于可可堿和咖啡堿之間，是咖啡堿的3.2倍左右，而在此之前，苦茶堿僅被發(fā)現(xiàn)于Camellia assamicavar.Kucha和Camellia sinensisvar.puanensisKurihara.兩個(gè)茶種中［9］，表明了禿房茶的又一特殊性。

表1 5份茶樹品種一芽一葉的生物堿組分（%）Table 1 Content of alkaloid in one bud with one leaf of five tea varieties

可可堿含量與咖啡堿含量同屬于數(shù)量性狀，因茶樹內(nèi)部條件如樹齡、發(fā)育階段和外部條件如季節(jié)、溫度、土壤等因素的影響會(huì)發(fā)生變化，但其總的分布規(guī)律是不變的?？煽蓧A在這些富含可可堿的茶種體內(nèi)的分布規(guī)律與Camellia sinensis茶種相同，與咖啡堿的分布規(guī)律也基本相似［10］?？煽蓧A集中分布在新嫩的茶梢中，隨著葉質(zhì)的老化而逐漸減少，而在葉片之外的器官如茶花、莖梗、茶籽和根部的含量極其微少［11］。可可堿在禿房茶的第一葉中含量最高，達(dá)到39.72 mg/g，而第四葉的可可堿含量?jī)H有14.37 mg/g，降低了63.8%左右（圖1）［6］。

圖1 禿房茶葉片的可可堿和咖啡堿含量Fig.1 Contents of theobromine and caffeine in CGY leaves of Camellia gymnogyna Chang

1.2 其他品質(zhì)成分組成特征

富含可可堿的茶樹除了在生物堿的組成上與龍井43不同外，其兒茶素單體的組成和含量也與龍井43有很大的區(qū)別，而茶多酚總量、黃酮類化合物含量和氨基酸含量沒有顯著差異。可可茶、厚軸茶和禿房茶的茶多酚總質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為31.39%、28.22%和35.73%，黃酮類化合物質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.37%、1.20%和1.81%，氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為3.48%、1.22%和2.16%［5-7］。

茶葉中的兒茶素分為簡(jiǎn)單兒茶素和酯型兒茶素，是茶葉多酚類的主要組分和茶葉保健功效的首要成分，對(duì)茶葉感官品質(zhì)的形成起著重要的作用，通常占茶葉干重的12%～24%［12-14］。對(duì)于各主要兒茶素組分，傳統(tǒng)茶樹Camellia sinensis如龍井43的優(yōu)勢(shì)兒茶素單體為表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）質(zhì)量分?jǐn)?shù)在6.27%，其次為表兒茶素沒食子酸酯（ECG），而不含沒食子兒茶素沒食子酸酯（GCG），其組分由大到小為EGCG＞ECG＞C＞GC＞EGC＞EC。與 龍 井43相反，可可茶和紅芽茶的組分特點(diǎn)相似，兩者的優(yōu)勢(shì)兒茶素均為GCG［15-16］，質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為8.07%和10.20%，其次為沒食子兒茶素（GC）和兒茶素（C），而EGCG、ECG和表沒食子兒茶素（EGC）的質(zhì)量分?jǐn)?shù)都顯著低于龍井43，且不含表兒茶素單體（EC），兒茶素組分由大到小為GCG＞C＞GC＞EGCG＞ECG＞EGC；禿房茶的優(yōu)勢(shì)兒茶素為EGCG，質(zhì)量分?jǐn)?shù)約為龍井43的50%，其次為C（2.46%），其組分由大到小為EGCG＞C＞EGC＞ECG＞EC＞GC＞GCG［6］（表2）。EGCG一般被認(rèn)為是綠茶中最具有生物活性的成分，參與人體膽固醇代謝等多種代謝途徑，而現(xiàn)有許多研究發(fā)現(xiàn)GCG抑制膽固醇的吸收效率要優(yōu)于EGCG；在抗菌活性方面，GCG對(duì)芽孢桿菌（Bacillus cereusis）的抑制作用優(yōu)于EGCG，對(duì)韋羅毒素（Vero toxins）的釋放也有良好的抑制效果；此外，GCG的苦澀味也顯著低于EGCG，說明高含量GCG能提高茶葉的滋味品質(zhì)［17-18］。這表明以GCG為主要兒茶素單體的可可茶和紅芽茶具有較大的資源挖掘價(jià)值。

表2 4份茶樹品種一芽一葉的兒茶素組分含量（%）Table 2 Content of catechin in one bud with one leaf of four tea varieties

2 可可堿在茶樹體內(nèi)的生物代謝

2.1 可可堿的生物合成

在茶樹（Camellia sinensis）體內(nèi)如龍井43，可可堿是咖啡堿合成過程的中間產(chǎn)物，而在零咖啡堿茶樹如紅芽茶和可可茶中，可可堿則作為最終產(chǎn)物，其主要合成途徑為：黃苷→7-甲基黃苷→7-甲基黃嘌呤→可可堿（3,7-二甲基黃嘌呤）［19-20］。首先，在黃苷-N-甲基轉(zhuǎn)移酶的作用下，黃苷的7-N-甲基化并轉(zhuǎn)化為7-甲基黃苷（8）；7-甲基黃苷在黃苷酶的催化下水解生成7-甲基黃嘌呤（17）；7-甲基黃嘌呤經(jīng)可可堿合成酶（單甲基黃嘌呤-N-甲基轉(zhuǎn)移酶）的作用進(jìn)一步甲基化轉(zhuǎn)化成可可堿（18）。另外，Ashihara等［21］發(fā)現(xiàn)在茶樹幼葉中還存在另外一條可可堿合成路徑，即黃苷→黃嘌呤→3-甲基黃嘌呤→可可堿（19-21）（圖2）。

圖2 可可堿的生物代謝途徑Fig.2 Biological metabolic pathway of theobromine

黃苷是嘌呤生物堿合成的起始底物，主要合成途徑包括二次利用途徑（De novo途徑）、S-腺苷-L-蛋氨酸循環(huán)途徑（SAM途徑）、鳥嘌呤核苷酸途徑（GMP途徑）和腺嘌呤核苷酸合成途徑（AMP途徑）［22］。

（1）De novo途徑：次黃苷酸（IMP）→黃苷酸（XMP）→黃苷。IMP在脫氫酶的作用下生成XMP（6），繼而在5’-核苷酶的作用下生成黃苷（7）。其中，IMP脫氫酶是該途徑的控速因子，決定了De novo途徑的效率［23］。

（2）SAM途徑：腺苷→AMP→IMP→XMP→黃苷。SAM是咖啡堿合成途徑中三步甲基化反應(yīng)的甲基供體，SAM首先被轉(zhuǎn)化為S-腺苷-L-半胱氨酸（SAH），然后水解為半胱氨酸和腺苷。半胱氨酸通過SAM循環(huán)途徑來補(bǔ)救SAM水平，腺苷則從循環(huán)中釋放出來繼而直接轉(zhuǎn)化為AMP進(jìn)入黃苷合成途徑或先經(jīng)腺苷核苷酶作用轉(zhuǎn)化為腺嘌呤再經(jīng)腺嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶作用轉(zhuǎn)化為AMP進(jìn)入黃苷合成途徑（5-7）。腺苷除了生成AMP進(jìn)入嘌呤堿合成途徑，還有一部在腺苷核苷酶的作用下轉(zhuǎn)化為腺嘌呤進(jìn)入腺嘌呤核苷酸池（2-4）［24］。

（3）GMP途徑：GMP（鳥嘌呤核苷酸）→鳥苷→黃苷。其過程為GMP經(jīng)5’-核苷酶的催化生成鳥苷（12），繼而在脫氨酶的作用下生成黃苷（13）。鳥苷除了生成黃苷進(jìn)入嘌呤堿合成途徑，還有一部在鳥苷核苷酶的作用下轉(zhuǎn)化為鳥嘌呤進(jìn)入鳥嘌呤核苷酸池（14,15,12）［25］。

（4）AMP途徑：AMP→IMP→XMP→黃苷。其過程為AMP在脫氨酶的作用下脫去氨基轉(zhuǎn)化為IMP（5），IMP在脫氫酶的作用下生成XMP（6），繼而在5’-核苷酶的作用下生成黃苷（7）（圖2）。

2.2 可可堿的分解代謝

14C同位素示蹤實(shí)驗(yàn)證明可可堿的分解首先經(jīng)過兩步脫甲基化轉(zhuǎn)化為黃嘌呤（24,25），再經(jīng)黃嘌呤降解途徑最終分解為CO2和NH3（26-30），即可可堿→3-甲基黃嘌呤→黃嘌呤→尿酸→尿囊素→尿囊酸→尿素→CO2和NH3［26-27］（圖2）。其過程如下：可可堿（3,7-二甲基黃嘌呤）首先脫去7-甲基轉(zhuǎn)化為3-甲基黃嘌呤，再經(jīng)3-N-脫甲基酶的催化轉(zhuǎn)化為黃嘌呤，黃嘌呤最初經(jīng)黃嘌呤脫氫酶氧化生成尿酸，進(jìn)一步在尿酸氧化酶的作用下氧化生成尿囊素，繼而被尿囊素酶水解為尿囊酸，然后經(jīng)尿囊酸酶水解生成尿素，最終在尿酶的作用下分解為CO2和NH3?？煽蓧A等嘌呤生物堿在茶樹體內(nèi)的分解代謝主要發(fā)生在老葉中，其代謝產(chǎn)物可作為儲(chǔ)備物質(zhì)供再次利用［22］。

3 可可堿在茶樹體內(nèi)富含的分子機(jī)理

3.1 NMT與SAM

N-甲基轉(zhuǎn)移酶（N-methyltransferase, NMT）和S-腺苷-L-蛋氨酸（S-adenosyl-L-methionine,SAM）是嘌呤堿合成的關(guān)鍵物質(zhì)，嘌呤堿的甲基化反應(yīng)是在NMT的催化作用下完成的，而NMT需依賴甲基供體SAM才能完成甲基化反應(yīng)［28］。Motiff A、B和C是廣泛分布在嘌呤堿合成酶氨基酸序列中的保守結(jié)構(gòu)域，對(duì)識(shí)別嘌呤環(huán)N-甲基化位置起著重要的作用［29-30］。從黃苷到可可堿的生成主要涉及到兩步甲基化反應(yīng)，由7-甲基黃苷合成酶（催化黃苷形成7-甲基黃苷）和可可堿合成酶（3,7-二甲基黃嘌呤合成酶，催化7-甲基黃嘌呤形成可可堿）催化完成。例如，禿房茶可可堿合成酶CgcTS專一催化7-甲基黃嘌呤轉(zhuǎn)化為可可堿，其轉(zhuǎn)錄和翻譯水平以及可可堿在禿房茶中的分布規(guī)律一致，均為幼嫩葉高而老化葉低［6］。

3.2 氨基酸殘基突變

在以咖啡堿為主的茶樹品種中，可可堿會(huì)在咖啡堿合成酶（1,3,7-三甲基黃嘌呤合成酶）的作用下進(jìn)一步甲基化并轉(zhuǎn)化為咖啡堿，在茶樹體內(nèi)的積累很少。TCS1是最初從茶樹（Camellia sinensis）幼葉中提取純化得到的咖啡堿合成酶，其編碼cDNA由1 483對(duì)堿基組成，編碼369個(gè)氨基酸，既可催化7-甲基黃嘌呤轉(zhuǎn)化為可可堿，也可催化可可堿轉(zhuǎn)化形成咖啡堿［31-32］。HYC和CCT分別是紅芽茶和可可茶的咖啡堿合成酶基因，編碼365個(gè)氨基酸，僅第287位（Arg287His）氨基酸不同，但其編碼蛋白酶HYC和CCT均只能催化可可堿的形成而不能以可可堿為底物繼續(xù)合成咖啡堿［5］，說明HYC和CCT只具有3-N-甲基化活性而不具有1-N-甲基化活性［33］。氨基酸序列比對(duì)結(jié)果表明，TCS1、HYC和CCT均具有SAM靶結(jié)合位點(diǎn)保守性結(jié)構(gòu)域motiff A、B’、C和YFFF，但與TCS1不同的是，HYC和CCT的第221位氨基酸均為組氨酸（H），而TCS1的則為精氨酸（R）（圖3），已有研究證明組氨酸在底物識(shí)別中扮演著重要的角色［34］。

圖3 咖啡堿合成酶的氨基酸序列比對(duì)結(jié)果Fig.3 Comparison result of the amino acid sequences of caffeine synthases

因此，咖啡堿合成酶的活性位點(diǎn)氨基酸殘基在富含可可堿的茶樹體內(nèi)與富含咖啡堿的茶樹體內(nèi)的差異可能是導(dǎo)致其只具有3-N-甲基化活性催化7-甲基黃嘌呤形成可可堿而無法進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為咖啡堿的重要原因。針對(duì)于可可茶的體外堿基恢復(fù)突變實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)把CCT1的第221號(hào)組氨酸（H）替換為精氨酸（R），或者把CCT1的第110～283位的氨基酸序列替換為TCS1的相應(yīng)序列時(shí)，重組后的CCT1則具有了合成咖啡堿的能力［33,35］。從而，我們可以得出咖啡堿合成酶的活性位點(diǎn)氨基酸殘基的突變改變了N-甲基轉(zhuǎn)移酶的底物特異性，是導(dǎo)致咖啡堿合成酶無法繼續(xù)合成咖啡堿并使得可可堿富集的重要分子機(jī)理。

另外，可可堿在茶樹體內(nèi)的生物代謝與蛋白質(zhì)、嘌呤核苷酸等的代謝密切相關(guān)。在蛋白質(zhì)、嘌呤核苷酸代謝旺盛的茶樹新梢中，CgcTS、HYC和CCT轉(zhuǎn)錄水平高，可可堿以合成代謝為主，分解代謝緩慢，因此含量較高。

4 展望

富含可可堿的茶樹以其低含量咖啡堿的特點(diǎn)使得人們?cè)陲嬘闷洳柚破窌r(shí)不會(huì)產(chǎn)生過多攝入咖啡堿引起的負(fù)面影響。除此之外，由這些茶樹鮮葉按照傳統(tǒng)加工工藝制成的茶葉在風(fēng)味品質(zhì)上與普通茶葉并不存在顯著的差別，而又因其高含量可可堿的特點(diǎn)具備了與普通茶葉不同的養(yǎng)生效果?？煽刹璞徽J(rèn)為是一種保健飲料，當(dāng)?shù)鼐用穹Q為“百歲茶”，是一種有效的解熱劑，具有解毒和降低血脂的作用，而且具有突出的保護(hù)缺氧心肌、膳食抗氧化、抗炎和一定的抗腫瘤功效［36］。低咖啡堿茶產(chǎn)品以其特殊的功效逐漸形成一種消費(fèi)主流，但市場(chǎng)上流通的低咖啡堿茶產(chǎn)品大多通過物理、化學(xué)等加工工藝來脫除茶葉咖啡堿，其加工成本高并存在一定的溶劑殘留［37-38］，而且在很大程度上影響到成品茶的風(fēng)味品質(zhì)，降低了消費(fèi)者的品飲體驗(yàn)。而天然富含可可堿的茶樹則是以其自身基因遺傳特性決定的低咖啡堿茶樹種質(zhì)資源，其鮮葉通過傳統(tǒng)的加工工藝便可制成低咖啡堿、高可可堿茶葉，極大地節(jié)省了再加工的成本，同時(shí)也保證了消費(fèi)者的感官體驗(yàn)。但由于這類茶樹資源稀少，人工栽培面積少，其茶產(chǎn)品尚不能滿足市場(chǎng)的需求，因此深度挖掘利用富含可可堿茶樹資源成了重要的課題。

茶樹資源的繁殖主要有常規(guī)雜交育種、扦插、嫁接和基因工程等手段。目前對(duì)于富含可可堿茶樹的繁育主要通過扦插和嫁接兩種方法，但成活率偏低，且存在遺傳不穩(wěn)定現(xiàn)象，成為大面積種植的難題。因此，提高扦插成活率和遺傳穩(wěn)定性是擴(kuò)繁這類茶樹資源所亟待解決的問題。常規(guī)雜交育種培育較經(jīng)濟(jì)、安全、有效，紅芽茶、可可茶這類茶樹資源可以作為常規(guī)育種的優(yōu)質(zhì)母本材料，但茶樹屬于木本植物，生長(zhǎng)周期長(zhǎng)，投入成本高，達(dá)不到良好的效果［39］?；蚬こ逃N以其周期短、定向選擇的優(yōu)勢(shì)成為選育低咖啡堿茶樹品種的重要科學(xué)方法，但茶樹轉(zhuǎn)基因一直是難以攻破的難題。2011年印度科學(xué)家以茶樹幼苗子葉和根系為對(duì)象利用RNAi介導(dǎo)的方法成功獲得18株轉(zhuǎn)基因植株，其咖啡堿含量下降幅度達(dá)44%～61%，成為茶樹轉(zhuǎn)基因去咖啡堿育種的一道曙光［40-41］。隨著對(duì)富含可可堿茶樹體內(nèi)生物堿的代謝途徑和規(guī)律以及可可堿積累的分子調(diào)控機(jī)理逐漸明確，為繁育高可可堿、低咖啡堿的茶樹品種奠定了理論基礎(chǔ)。