殷智穎，張 野，徐土炳

目前，慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B，CHB)患者已經(jīng)在全球范圍內(nèi)廣泛存在[1]，其中非洲和亞洲范圍內(nèi)流行率較高。根據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)報道，全世界約有20億人群曾經(jīng)感染過乙型肝炎病毒(hepatitis B, HBV)，而約2.4億人為CHB患者。HBV感染是導致肝硬化和肝細胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)的主要原因[2，3]。全世界每年約有65萬人因肝功能衰竭、肝硬化或HCC而死亡[4，5]。血清HBeAg是HBV復制和傳染的標志，與HBV DNA呈正相關(guān)[6]。臨床上，一般將HBV感染分為免疫耐受期、免疫清除期、非活動期和再活動期等期相[7]。HBV復制和宿主免疫力受損將導致疾病發(fā)作[8]。由于CHB患者固有免疫系統(tǒng)受到損害，導致機體不能有效清除病毒，從而發(fā)生慢性持續(xù)性感染。自然殺傷細胞(nature killer cells, NK細胞)主要集中在肝臟內(nèi)。在肝臟，NK細胞占淋巴細胞的三分之一，而在外周血中只占5%～15%[9]。NK細胞在免疫系統(tǒng)中是清除病原體和異常細胞的效應細胞，可以通過殺傷功能和分泌細胞因子而發(fā)揮作用。國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)CHB患者NK細胞數(shù)量減少，其分泌細胞因子的功能受損，因而NK細胞是研究CHB患者發(fā)病機制和治療方案選擇的重要依據(jù)。殺傷細胞凝集素樣受體亞家族G成員1(killer cell lectin-like receptor subfamily G member 1, KLRG1)是在大鼠黏膜肥大細胞株中首次被發(fā)現(xiàn)，是一類可以抑制炎癥介質(zhì)釋放的受體。在人體，KLRG1主要表達于NK細胞和T細胞[10]。目前，已有學者研究發(fā)現(xiàn)丙型肝炎患者外周血NK細胞KLRG1表達可以導致NK細胞頻數(shù)減少和功能損害[11]，可能與HCV抑制了NK細胞的復制，促進NK細胞凋亡，并抑制NK細胞釋放炎性細胞因子有關(guān)。本研究檢測了CHB患者外周血KLRG1陽性NA細胞百分比及其NK細胞殺傷功能的變化，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 2017年3月～2019年3月我院收治的CHB患者120例，男性87例，女性33例；年齡28～63歲，平均年齡為(43.7±5.4)歲。診斷符合2015年中華醫(yī)學會制定的《慢性乙型肝炎防治指南》。排除標準：①肝硬化、肝功能衰竭或肝臟惡性腫瘤；②合并有酒精性肝病、自身免疫性肝病、藥物性肝損傷；③合并有甲型、丙型、丁型肝炎、人類免疫缺陷病毒(HIV)、EB病毒或巨細胞病毒感染；④孕婦或哺乳期女性。另選擇健康體檢者120例，男性77例，女性43例；年齡30～62歲，平均年齡為(42.5±5.2)歲。本研究經(jīng)我院醫(yī)學倫理委員會審核同意，入組人員簽署知情同意書。

1.2 外周血NK細胞百分比檢測 采集外周靜脈血，抗凝，12000 r/m離心10 min，棄去上清液，與等量D-Hanks液均勻稀釋，應用Ficoll淋巴細胞分離液(TBD公司)，分離單個核細胞。取細胞加入EP管，分別加入Percp-5.5標記的抗人CD3抗體、FITC標記的抗人CD56抗體、APC標記的抗人KLRG1抗體(eBiosicence公司)，避光放置30 min，洗滌，并重懸于流式管中，使用流式細胞儀(美國BECKMAN公司)檢測。

1.3 分泌γ-干擾素的NK細胞檢測 取單個核細胞，加入96孔板，每孔2×105個細胞，體積約100μL。加入含胎牛血清(澳洲Hyclone公司)的1640培養(yǎng)液100μL，每孔分別加入100 ng/mL丙二醇甲醚醋酸酯(PMA，聯(lián)科生物公司)和1μg/mL離子霉素(聯(lián)科生物公司)培養(yǎng)2 h。然后，加入1μg/mL布雷菲德菌素A，培養(yǎng)4 h，以阻斷細胞因子的分泌。將細胞轉(zhuǎn)入EP管，加入Percp-5.5標記的抗人CD3抗體、FITC標記的抗人CD56抗體、APC標記的抗人KLRG1熒光抗體標記，使用BD公司提供的試劑盒固定細胞并透化，洗滌細胞2次，用PECY 7-IFN-γ(eBiosicence公司)染色，再上流式細胞儀檢測分泌γ-干擾素的NK細胞比例。

1.4 NK細胞表型分子檢測 調(diào)整PBMCs濃度為5×106/ml, 取100μl置于流式管中, 加入表型抗體 (抗CD38、抗CD69、抗HLA-DR、抗TRAIL) ，混勻，室溫避光孵育25 min。加入PBS 1 ml， 混勻, 400×g離心、洗滌5 min。棄上清，拍干。加入破膜劑300μl/管，4℃避光破膜30 min。用破膜洗液離心洗滌，加入胞內(nèi)抗體 (抗perforin、抗Granzyme A和抗Granzyme B)，室溫避光孵育25 min。加入破膜洗液，離心洗滌后棄上清，拍干。用1%多聚甲醛液200μl重懸細胞， 4℃避光保存，24 h內(nèi)上流式細胞儀檢測。

1.5 NK細胞殺傷實驗 取純化的外周血NK細胞, 按20萬/孔鋪于96孔圓底細胞培養(yǎng)板, 同時加入LX-2細胞 2×104個/孔, 置37℃、CO2細胞培養(yǎng)箱共培養(yǎng)6 h，收集細胞，檢測LX-2細胞凋亡情況，用預冷的PBS收取細胞至流式管中，離心洗滌后每管加入Annexin-V緩沖液100μl，重懸細胞，加入抗Annexin-V熒光抗體, 室溫避光染色5 min，加入7AAD熒光抗體, 室溫避光染色10 min。每管加入Annexin-V緩沖液100μl，終止染色, 立即上流式細胞儀檢測。

2 結(jié)果

2.1 兩組外周血NK細胞百分率比較 CHB患者外周血NK細胞和KLRG1+NK細胞百分比顯著高于，而分泌IFN-γ的NK細胞百分率顯著低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，表1)。

表1 兩組外周血NK細胞百分率比較

與對照組比，①P<0.05

2.2 兩組外周血NK細胞表型比較 CHB患者外周血NK細胞活化程度增高，NK細胞CD38、CD69、HLA-DR和TRAIL表達均顯著高于對照組(P=0.012，P=0.015，P=0.025，P=0.019,圖1)。

圖1 兩組外周血NK細胞表型比較

2.3 兩組NK細胞殺傷能力比較 CHB患者NK細胞誘導LX-2細胞發(fā)生早期凋亡率為11.5%(6.6%～13.7%)，晚期凋亡率為7.2% (5.1%～8.5%)，與對照組的15.4% (11.5%～24.3%)和13.5% (8.1%～20.4%) 比，顯著降低 (U=6.50,P=0.025；U=2.02，P=0.002，圖2) 。

圖2 NK細胞對LX-2細胞的殺傷能力比較

3 討論

在急性HBV感染階段，患者的免疫能力瞬時發(fā)揮作用，同時引發(fā)相應的特異性免疫反應，在成人可導致感染的終止[12-14]。免疫系統(tǒng)對病原體識別主要是通過病原體相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular patterns, PAMP)而完成[13-17]，也稱為病原體識別受體(pathogen recognition receptors, PRR)。PRR有許多種類，如Toll受體、維甲酸誘導性基因I受體(RIG)、核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)受體(NOD)、C型凝集素和DNA感應受體，這些受體通常在各自相應的上皮細胞/內(nèi)皮細胞、特異/非特異免疫細胞中表達。一旦PRR與相應PAMP結(jié)合后，下游信號通路便會隨之激活，如銜接子和共銜接子、激酶、轉(zhuǎn)錄因子[18]等。轉(zhuǎn)錄因子中包含干擾素調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子。在信號通路激活后，干擾素刺激基因變化開始表達，從而形成各類干擾素[19]、促炎性細胞因子、趨化因子[20]等。本研究中，通過γ干擾素的分泌來分析NK細胞的功能。NK細胞在抵御病原體侵入時位于第一道防線，其數(shù)量減少會導致患者對于HBV的免疫能力下降。抵抗病毒的干擾素減少。本研究中，CHB患者分泌γ干擾素的NK細胞比例明顯低于對照組(P< 0.05)。

KLRG1在細胞質(zhì)結(jié)構(gòu)含有免疫受體，為酪氨酸抑制性基序(ITIM)，在細胞外區(qū)域則含有凝集素樣結(jié)構(gòu)域，屬于跨膜蛋白。KLRG1屬于鈣粘蛋白受體，而E-鈣粘蛋白受體在外周血細胞表達，在髓樣樹突狀細胞(DC)上則沒有發(fā)現(xiàn)N-鈣粘蛋白受體。KLRG1通常在人體NK細胞和T細胞表達，是一種抑制性受體。年輕人CD8+T細胞上KLRG1表達約為40%，在CD4+T細胞上表達約為20%。隨著年齡的增長，KLRG1在CD8+T細胞上的表達也會明顯增加。到65歲時，其表達可達90%。表達KLRG1的T細胞增殖能力減弱。近些年來，已經(jīng)有研究表明艾滋病毒、巨細胞病毒和皰疹病毒重復刺激可以增加CD8+T細胞上KLRG1的表達。對于NK細胞上KLRG1的表達研究還不夠清楚。本研究中，CHB患者PBMC中KLRG1+NK細胞的比例增加，同時，CHB患者分泌γ干擾素的NK細胞比率明顯比健康人減少。

自2006年在小鼠模型上證實NK細胞可通過NKG2D和TRAIL依賴方式殺傷活化的肝星狀細胞(HSCs)以來，發(fā)現(xiàn)其能抑制肝纖維化【21】，NK細胞的抗纖維化作用即被廣泛關(guān)注。目前認為NK細胞抗纖維化功能主要包括殺傷活化的HSCs和分泌IFN-γ，誘導HSCs凋亡及阻滯細胞周期等[22,23]。本研究通過檢測分泌IFN-γ的NK細胞頻數(shù)及NK細胞在體外對LX-2細胞的直接殺傷能力來反映NK細胞的抗纖維化功能，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CHB患者外周血分泌IFN-γ的NK細胞頻數(shù)與對照組相比顯著降低。與此同時，CHB患者NK細胞誘導LX-2細胞發(fā)生早期凋亡和晚期凋亡的比例均顯著低于對照組，即CHB患者外周血NK細胞對LX-2細胞的殺傷能力減弱。這些結(jié)果提示CHB患者NK細胞處于抗纖維化功能受損狀態(tài)。

盡管本研究經(jīng)過嚴格的實驗設(shè)計，但是各種檢測依賴的技術(shù)水平較高，很難保證結(jié)果的可靠性，需重復實驗驗證。另外，針對KLRG1的研究尚屬探索階段，有待于未來更大樣本、更細致的深入研究。盡管如此，本研究發(fā)現(xiàn)CHB患者外周血KLRG1+NK百分率增高，而分泌γ-干擾素的功能降低，這次發(fā)現(xiàn)可能影響CHB患者的疾病轉(zhuǎn)歸和治療方案的選擇，因而是非常重要的。