黃橘村，胡東輝，張建軍，田德英

MicroRNA-203( miR-203)是miRNAs家族中重要的成員。MiR-203位于人染色體14q32.33，該區(qū)域?qū)儆诓环€(wěn)定區(qū)域，編碼人類約12%miRNA[1]。研究發(fā)現(xiàn)，miR-203與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，miR-203過表達(dá)后有抑癌作用[2]。也有研究表明，miR-203對于人類皮膚的形態(tài)發(fā)育和功能維持有調(diào)控作用[3]。目前，關(guān)于miR-203的研究很多，但是miR-203對酒精性肝病(alcoholic liver disease, ALD)影響的研究還較少。ALD主要包括酒精性脂肪肝、酒精性肝炎和酒精性肝硬化等，其主要的致病原因就是長期過量飲酒。研究發(fā)現(xiàn)，ALD與機(jī)體的氧化應(yīng)激、細(xì)胞轉(zhuǎn)化因子表達(dá)和炎癥介質(zhì)釋放等有關(guān)[4]。本研究采用慢病毒介導(dǎo)miR-203過表達(dá)觀察了ALD大鼠肝組織氧化損傷和炎癥反應(yīng)的變化，以探討miR-203參與ALD發(fā)病的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動物、儀器與試劑 SPF級雄性SD大鼠，體質(zhì)量180～220 g(由湖南長沙市天勤生物技術(shù)有限公司提供，動物質(zhì)量合格證編號：43006700005608)。相差顯微鏡(Leica)，多功能酶標(biāo)儀(Thermo Scientific MultiSkan Go)，PCR分析儀(蘇州東勝興業(yè)科學(xué)儀器有限公司)，電泳儀電源(Tanon)，全自動生化分析儀(日本日立公司)。紅星二鍋頭酒(北京紅星股份有限公司，批號：6906785230165)。miR-203慢病毒質(zhì)粒(上海吉瑪基因股份有限公司)。檢測丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)和總膽紅素(TBIL)試劑盒(北京利德曼生化技術(shù)有限公司)。檢測超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)和丙二醛(MDA)試劑盒(南京建成生物工程研究所)?？?actin抗體(PTG)、抗NF-κB和抗IL-1β抗體(Abcam)。BCA蛋白濃度測定試劑盒(Beyotime Biotechnology)。

1.2 慢病毒介導(dǎo)的miR-203過表達(dá)和ALD大鼠模型的建立[5]取60只SD大鼠，隨機(jī)分為A組：即ALD組，B組：即NC-miRNA/ALD和C組：即miR-203/ALD。在建立ALD大鼠模型前，在B組大鼠，使用胰島素注射器通過尾靜脈注射NC-miRNA慢病毒空質(zhì)粒，作為陰性對照，在C組大鼠，注入miR-203慢病毒表達(dá)質(zhì)粒。在病毒感染后第1 d，給予各組大鼠隨意飲用5%酒精，連續(xù)3 d，第4 d換成10%酒精，以后每隔1 w增加2%酒精濃度，直至達(dá)到22%酒精。自飲用22%酒精開始，給予54%酒精2 mL.d-1分3次灌胃，連續(xù)8 w。

1.3 大鼠肝組織miR-203水平檢測 在造模8 w，麻醉處死大鼠，取肝組織，置于10%福爾馬林溶液中固定，行石蠟包埋、切片、HE染色，并在光鏡下觀察。另取肝組織，采用TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit提取RNA，采用TaqMan Small RNA Assays行miR-203逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，再采用Realtime PCR法檢測，采用2-ΔΔCt法計(jì)算miR-203水平。正向引物序列：5’GUGAAAUGUUUAGGACCACUAG-3’，反向引物序列：5’-CCAGUGGUUCUUAACAGUUCAAC-3’。

1.4 肝組織勻漿SOD、CAT和MDA檢測 在造模8 w處死大鼠，取新鮮的肝組織勻漿，采用ELISA法檢測。

1.5 肝組織IL-1β和細(xì)胞核NF-κB蛋白表達(dá)檢測 另取肝組織，分別采用細(xì)胞核提取試劑盒或普通組織裂解液裂解肝組織，低溫離心，取上清液采用BCA試劑盒進(jìn)行蛋白定量，配膠，采用Western Blot法檢測，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，加一抗4℃過夜，加二抗孵育2 h，顯影，進(jìn)行半定量分析。

2 結(jié)果

2.1 各組ALD大鼠血生化指標(biāo)變化的比較 C組動物血清AST、ALT和TBIL水平顯著低于B組(P<0.05，表1)。

表1 各組大鼠血清生化指標(biāo)比較

與其他兩組比，①P<0.05

2.2 兩組大鼠肝組織miR-203水平比較 在構(gòu)建ALD模型8 w末，經(jīng)Realtime PCR法檢測發(fā)現(xiàn)，C組大鼠肝組織miR-203水平為(2.8±0.1)，顯著高于B組【(1.3±0.5)，P<0.05】，表明慢病毒介導(dǎo)的miR-203過表達(dá)ALD大鼠模型成功建立。

2.3 各組肝組織病理學(xué)表現(xiàn)比較 A組大鼠肝細(xì)胞壞死、空泡變性，有炎性細(xì)胞浸潤；B組動物肝組織與A組表現(xiàn)相似；C組大鼠肝小葉內(nèi)偶見肝細(xì)胞壞死，有少量的炎性細(xì)胞浸潤(圖 1)，結(jié)果表明miR-203過表達(dá)對于ALD大鼠肝組織損傷有明顯的保護(hù)作用。

圖1 三組大鼠肝組織形態(tài)學(xué)觀察(HE，×400)

2.4 各組大鼠肝臟組織SOD、CAT和MDA水平比較 C組肝組織SOD和CAT水平顯著高于，而MDA水平顯著低于B組或A組(P<0.05，表2)，說明miR-203過表達(dá)能顯著提高肝組織的抗氧化能力，從而減輕肝損傷。

表2 各組大鼠肝組織SOD、CAT和MDA水平比較

與其他兩組比，①P<0.05

2.5 各組大鼠肝組織NF-κB和IL-1β表達(dá)情況的比較 經(jīng)Western Blot檢測結(jié)果表明，A組和B組肝組織NF-κB和IL-1β蛋白表達(dá)水平均顯著增強(qiáng)，說明導(dǎo)入空載體質(zhì)粒對于肝損傷無明顯影響。與B組比，C組肝組織IL-1β蛋白和NF-κB蛋白表達(dá)明顯減弱(圖2，表3)，說明miR-203過表達(dá)后可能通過抗氧化和抗炎作用機(jī)制對肝組織起到了保護(hù)作用。

圖2 各組肝組織NF-κB和IL-1β蛋白表達(dá)比較

表3 各組大鼠肝組織IL-1β和NF-κB蛋白比較

與其他兩組比，①P<0.05

3 討論

MiRNA是現(xiàn)代分子生物學(xué)領(lǐng)域里研究的熱點(diǎn)[6]。隨著研究的深入，miR-203的作用逐漸被發(fā)現(xiàn)被認(rèn)知[7-10]，miR-203在皮膚上皮組織生理、病理過程中有著重要的作用。MiR-203具有誘導(dǎo)細(xì)胞分化、促進(jìn)細(xì)胞自噬、細(xì)胞凋亡和抑癌等作用，其在各種疾病中的具體作用都有待進(jìn)一步闡明[11-14]。MiRNA203在ALD發(fā)病過程中的作用鮮有報(bào)道。有研究表明，miR-203對胃癌細(xì)胞的遷徙和細(xì)胞凋亡均有影響，能夠促進(jìn)胃癌細(xì)胞的凋亡，有抗胃癌的作用[15]。本研究表明，通過慢病毒轉(zhuǎn)染大鼠miR-203，在大鼠肝臟組織中出現(xiàn)miR-203過表達(dá)，并且miR-203過表達(dá)后對于肝組織的病理損傷也能起到一定的保護(hù)作用。

一般將ALD分為急性和慢性肝損傷，嚴(yán)重酗酒或長期大量飲酒都會造成ALD。ALD的具體發(fā)病機(jī)制比較復(fù)雜，目前比較公認(rèn)的發(fā)病機(jī)制有：乙醇及其代謝產(chǎn)物對肝臟有直接的毒副作用，乙醇還會誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激以及脂質(zhì)過氧化，細(xì)胞在氧化應(yīng)激的狀態(tài)下會產(chǎn)生一些內(nèi)毒素、細(xì)胞因子和炎性介質(zhì)等介導(dǎo)的炎性反應(yīng)。乙醇可能會使細(xì)胞缺氧，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞損傷。但是，目前尚未有具體明確的致病機(jī)制[16]。在肝臟受到損傷時，ALT和AST會從細(xì)胞內(nèi)滲出，釋放到血液中。血清ALT、AST和TBIL水平升高在一定程度上能夠反映肝細(xì)胞損傷的程度[17]。為了考察miR-203對ALD大鼠肝損傷的影響，我們檢測了各組動物血清ALT、AST和TBIL水平，結(jié)果C組大鼠血清ALT、AST和TBIL水平比B組顯著下降，提示miR-203具有保護(hù)肝細(xì)胞的作用，減輕了ALD動物肝細(xì)胞的損傷。ALD的損傷是很多因素共同導(dǎo)致的結(jié)果，其中還包括氧化應(yīng)激反應(yīng)、炎癥、細(xì)胞凋亡、缺氧、細(xì)胞因子作用等。在ALD個體，乙醇會改變腸粘膜的通透性，引起胃粘膜損傷，進(jìn)而抑制SOD和CAT的酶活性，并增加MDA的產(chǎn)量[18]。SOD、CAT和MDA是與細(xì)胞氧化應(yīng)激相關(guān)的指標(biāo)，為了進(jìn)一步探討miR-203對肝損傷的作用，我們又檢測了肝組織損傷后一些指標(biāo)的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)C組與B組比，肝組織勻漿CAT和SOD含量明顯升高，提示miR-203具有提高機(jī)體抗氧化能力。與B組相比，C組大鼠肝組織MDA含量顯著降低(P<0.05)。MDA作為膜脂質(zhì)過氧化物最重要的終產(chǎn)物，其含量反映了機(jī)體脂質(zhì)過氧化程度，間接反映肝細(xì)胞的受損程度。乙醇過量會誘導(dǎo)NF-κB等轉(zhuǎn)錄因子的磷酸化和核轉(zhuǎn)位，促使一些細(xì)胞因子的釋放，如IL-1β和IL-6等。NF-κB是細(xì)胞中重要的轉(zhuǎn)錄因子，與炎性介質(zhì)的轉(zhuǎn)錄表達(dá)和免疫反應(yīng)的調(diào)控相關(guān)。當(dāng)細(xì)胞處于正常狀態(tài)時，NF-κB在胞漿中處于非活性狀態(tài)，當(dāng)細(xì)胞受到一些外部刺激如缺氧、氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)時，NF-κB均可被激活[19,20]。NF-κB會從胞漿中進(jìn)入細(xì)胞核，從而使細(xì)胞核NF-κB明顯增多。核NF-κB激活后會激活其他信號通路的相關(guān)蛋白，進(jìn)而引起級聯(lián)放大效應(yīng)，會使人體出現(xiàn)更多的后續(xù)反應(yīng)。為了考察miR-203的抗炎作用機(jī)制，我們采用Western Blot法檢測了促炎因子IL-1β和核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB水平，結(jié)果C組大鼠肝細(xì)胞NF-κB和IL-1β表達(dá)顯著低于B組，實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示miR-203與NF-κB和IL-1β相關(guān)的炎癥反應(yīng)有關(guān)。

綜上所述，miR-203過表達(dá)對ALD動物肝損傷有明顯的保護(hù)作用，其可能是通過抗氧化和抗炎作用，從而對ALD起到了保護(hù)作用。