翟曉艷 裴亮 趙煥新 楊李旺 楊蓉 季新燕

1山西中醫(yī)藥大學(xué)解剖教研室，山西榆次 030619；2山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院泌尿外科，太原 030001；3山西中醫(yī)藥大學(xué)生理教研室山西榆次 030619；4山西中醫(yī)藥大學(xué)藥理教研室山西榆次 030619

隨著年齡的增加，人體的器官、組織修復(fù)能力均減弱，老年人創(chuàng)傷愈合的速度也減慢［1］。成纖維細(xì)胞作為皮膚創(chuàng)傷修復(fù)的重要參與者，提高其增殖能力和遷移到創(chuàng)傷區(qū)的能力對(duì)于促進(jìn)老年創(chuàng)傷愈合的意義重大［2?3］。沉默信息調(diào)節(jié)因子 2 同源類(lèi)似物 6（silent mating type information regulation 2 homolog 6，SIRT6）作為公認(rèn)的抗衰老因子，屬于3 類(lèi)組蛋白去乙?；浮Ｎ覀兦捌谘芯孔C實(shí)，SIRT6 可以提高老年人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖和遷移能力［4］，但是對(duì)老年人成纖維細(xì)胞的作用及機(jī)制還不清楚。本課題初步探討SIRT6 對(duì)老年人皮膚成纖維細(xì)胞增殖和遷移能力的影響及機(jī)制。

材料與方法

一、主要試劑和儀器

Iscove′s Modified Dulbecco′s Medium（IMDM）細(xì)胞培養(yǎng)基、澳洲胎牛血清（美國(guó)Gibco 公司），0.25%胰酶（上海索萊寶生物科技有限公司），CCK8試劑盒（日本同仁化學(xué)研究所），兔抗人SIRT6 多克隆抗體、鼠抗人β 肌動(dòng)蛋白（ACTB）單克隆抗體和鼠抗人p65 及磷酸化p65（p?p65）多克隆抗體（英國(guó)Abcam公司），辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG和山羊抗小鼠IgG 抗體（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司），高靈敏度化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒（上海漢恒生物科技有限公司），Trizol試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國(guó)賽默飛世爾科技有限公司），SYBR Green 熒光定量試劑盒（北京天根生物科技有限公司），倒置相差顯微鏡（德國(guó)萊卡公司），DUB00型核酸蛋白分析儀（美國(guó)Beckman Coulter 公司），熒光定量PCR 儀（美國(guó)賽默飛世爾科技有限公司）。

二、細(xì)胞培養(yǎng)

取山西醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院泌尿外科16 例健康男性包皮環(huán)切術(shù)切除的包皮皮膚組織，分離成纖維細(xì)胞［本研究已通過(guò)山西中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審查（批件號(hào)2019LL215），受試者均簽署知情同意書(shū)］。其中，青年組8例，年齡16 ～ 25（22.73±4.28）歲；老年組 8 例，年齡 50 ～ 70（57.36 ± 7.22）歲。剪去皮下組織，磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗后，剪碎組織，加入PBS 離心，將細(xì)胞和組織碎片培養(yǎng)于含20%胎牛血清的IMDM 培養(yǎng)液中（含0.25%膠原蛋白酶Ⅱ），置于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中消化、培養(yǎng)6 h。細(xì)胞貼壁后換為含20%胎牛血清的IMDM 培養(yǎng)液，待細(xì)胞80%融合后，0.25%胰酶消化，按1∶3 比例傳代。實(shí)驗(yàn)中所用的細(xì)胞均為第4 代細(xì)胞。

三、SIRT6基因轉(zhuǎn)染

委托廣州賽業(yè)生物科技有限公司構(gòu)建攜帶SIRT6 的慢病毒載體并合成病毒，將老年組皮膚成纖維細(xì)胞分成兩組，一組用SIRT6-慢病毒感染使其SIRT6 表達(dá)增高作為SIRT6 組，另一組以空病毒感染作為對(duì)照組。按照慢病毒感染實(shí)驗(yàn)手冊(cè)流程在老年人皮膚成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)至40% ～50%融合時(shí)，以8 mg/L 海美溴銨為助染劑感染成纖維細(xì)胞，感染復(fù)數(shù)（multiplicity of infection）值為30，18 h 后換成無(wú)病毒正常培養(yǎng)基，培養(yǎng)72 h后倒置熒光顯微鏡下觀(guān)察感染效率，提取總蛋白，Western 印跡法檢測(cè)SIRT6表達(dá)量，確定過(guò)表達(dá)SIRT6成功。

四、細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)

將不同年齡組人皮膚成纖維細(xì)胞和感染后72 h的老年人皮膚成纖維細(xì)胞以2.5 × 105/ml 接種于6 孔板（每孔2 ml）中過(guò)夜貼壁，用20 μl移液槍槍頭在孔的中央垂直做“十”字劃痕，用PBS 沖洗3 次，洗去劃痕處掉落的細(xì)胞，換為無(wú)血清IMDM 培養(yǎng)基，置于37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。分別在劃痕后即刻和24 h 拍照，用Image J 軟件測(cè)量劃痕處面積，計(jì)算遷移率。遷移率=（劃痕面積0h- 劃痕面積24h）/劃痕面積0h× 100%。

五、CCK8法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性

將不同年齡組人皮膚成纖維細(xì)胞和感染后72 h的老年人皮膚成纖維細(xì)胞接種于96孔板中（7 000個(gè)細(xì)胞/孔），加入含20%胎牛血清的IMDM 培養(yǎng)基中培養(yǎng)過(guò)夜貼壁，分別在細(xì)胞貼壁后0、12、24、48 h加入CCK8 試劑，37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育2 h后，用酶標(biāo)儀測(cè)450 nm 波長(zhǎng)處吸光度（A值）。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)設(shè)3 個(gè)復(fù)孔，取均值代表細(xì)胞活性。根據(jù)細(xì)胞增殖活性繪制生長(zhǎng)曲線(xiàn)。

六、Western 印跡法檢測(cè)人皮膚成纖維細(xì)胞p?p65表達(dá)

使用 RIPA（radio immunoprecipitatipon assay）蛋白裂解液提取不同年齡組人皮膚成纖維細(xì)胞和感染后72 h的老年人皮膚成纖維細(xì)胞總蛋白，用二喹啉甲酸法測(cè)定蛋白濃度。取30 μl 蛋白經(jīng)10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳后，轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜上，加5%脫脂牛奶封閉1.5 h 后，分別加入一抗兔抗人SIRT6 抗體（1∶1 000）、鼠抗人 p?p65 抗體（1∶500）、鼠抗人p?p65 抗體（1∶500）、鼠抗人 ACTB 抗體（1∶1 000），4 ℃過(guò)夜，TBST 洗 3次，加入1∶2 000 辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫避光孵育1 h，然后加入顯影液用圖像分析系統(tǒng)采圖，用Image J 軟件以ACTB為內(nèi)參照分析相對(duì)灰度值，蛋白相對(duì)表達(dá)水平=目標(biāo)蛋白灰度值/ACTB灰度值。

七、實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)Col1、Col3、Itgβ1、Itgα 3、Itgα5 mRNA水平

用Trizol 試劑提取老年人SIRT6 組和對(duì)照組皮膚成纖維細(xì)胞總RNA，依據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)反轉(zhuǎn)錄成cDNA。然后用SYBR Green 熒光定量法以ACTB為內(nèi)參進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)。ACTB正向引物5′?GATGTCGCACGGTACCTG?3′，反向引物5′?TCTCTGGTTCTTTCAATCGGG?3′；Col1 正向引物 5′?GAGGGCAACAGCAGGTTCACTTA?3′，反向引物 5′?TCACCACCACCGATGTCCA?3′；Col3 正向引物 5′?CCACGGAAACACTGGTGGAC?3′，反向引物 5′?GCCAGCTGCACATCAAGGAC?3′；Itgβ1 正向引物5′?TTGTGAAGCCAGCAACGGACAG?3′，反向引物 5′?CAAGGCAGGTCTGACACATCTCAC?3′；Itgα3 正向引物 5′?ACCTCCTCCTCCTCCTCTTCCTC?3′，反向引物5′?AGGCACAGGCTCTGGAGAACC?3′；Itgα5 正向引物5′?CGCCATCAGCACTGTGTCCAC?3′，反向引物 5′?AGCTGTGCAATGGACCAAGGC?3′。 反 應(yīng)條 件 ：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán) ；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s。以2-△△Ct表示目的基因mRNA相對(duì)表達(dá)量。

八、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用GraphPadPrism 5 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均為計(jì)量資料，以表示，兩組資料比較采用t?test檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

一、不同年齡組人皮膚成纖維細(xì)胞的形態(tài)

見(jiàn)圖1。倒置顯微鏡下，不同年齡組原代人成纖維細(xì)胞的形態(tài)沒(méi)有顯著差異，有散在細(xì)胞，也有圍繞在組織塊周?chē)史派錉钆帕械募?xì)胞，大部分為圓形或者梭形，細(xì)胞較小。第4 代時(shí)，細(xì)胞逐漸變大，梭形細(xì)胞逐漸扁平發(fā)出突起，其中老年組細(xì)胞突起更多。

二、皮膚成纖維細(xì)胞中SIRT6、p?p65表達(dá)

老年組人皮膚成纖維細(xì)胞中SIRT6 蛋白表達(dá)水平較青年組顯著下降（P＜ 0.05），但p?p65表達(dá)顯著升高（P＜ 0.05）。見(jiàn)圖2、表1。

三、皮膚成纖維細(xì)胞的遷移能力和增殖能力

圖1 不同年齡組人皮膚成纖維細(xì)胞傳代不同次數(shù)后細(xì)胞形態(tài) 黃色箭頭示散在細(xì)胞，紅色箭頭示放射狀排列的細(xì)胞。第4 代成纖維細(xì)胞較原代細(xì)胞增大，且逐漸扁平發(fā)出突起，老年組細(xì)胞突起更明顯

劃痕實(shí)驗(yàn)顯示，青年組人皮膚成纖維細(xì)胞24 h細(xì)胞遷移率為（94.63% ± 12.32%），老年組為43.81% ± 18.84%，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=5.903，P=0.003）。見(jiàn)圖3。

CCK8 實(shí)驗(yàn)顯示，12 h 時(shí)老年組與青年組人皮膚成纖維細(xì)胞活力均有增加，兩組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.991，P=0.512）；老年組24 h（t=4.043，P=0.007）和48 h（t=5.336，P=0.004）時(shí)的增殖活性明顯低于青年組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)圖4。

圖2 Western 印跡檢測(cè)不同年齡組人皮膚成纖維細(xì)胞中沉默信息調(diào)節(jié)因子2同源類(lèi)似物6（SIRT6）和p?p65蛋白表達(dá)水平

表1 不同年齡組人皮膚成纖維細(xì)胞中沉默信息調(diào)節(jié)因子2同源類(lèi)似物6（SIRT6）和p?p65蛋白表達(dá)水平比較（）

表1 不同年齡組人皮膚成纖維細(xì)胞中沉默信息調(diào)節(jié)因子2同源類(lèi)似物6（SIRT6）和p?p65蛋白表達(dá)水平比較（）

例數(shù)8 8組別青年組老年組t值P值SIRT6 1.000±0.067 0.434±0.179 3.040 0.012 p?p65 1.000±0.093 1.694±1.148 2.949 0.015 p65 4.316±0.303 4.732±0.475 0.863 0.408

圖3 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)不同年齡組人皮膚成纖維細(xì)胞的遷移能力 24 h時(shí)青年組人成纖維細(xì)胞較老年組劃痕寬度明顯降低

圖4 不同年齡組人皮膚成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn) 青年組和老年組人皮膚成纖維細(xì)胞增殖活性在12 h時(shí)沒(méi)有差異，24 h和48 h時(shí)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。a：P ＜0.01

四、SIRT6 過(guò)表達(dá)對(duì)老年組皮膚成纖維細(xì)胞遷移能力和增殖能力及Col 1、Col 3、Itgα1、Itgα3和Itgβ1 mRNA表達(dá)水平的影響

細(xì)胞感染后72 h 可見(jiàn)老年人皮膚成纖維細(xì)胞綠色熒光蛋白陽(yáng)性（圖5），且SIRT6 組細(xì)胞SIRT6蛋白表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組，t=3.040，P＜0.01，見(jiàn)圖6、表2。

劃痕實(shí)驗(yàn)顯示，SIRT6 組老年人成纖維細(xì)胞24 h 遷 移 率 為 68.30% ± 10.347% ，較 對(duì) 照 組39.48% ± 3.234%顯著改善，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t= 5.404，P＜ 0.05）（圖 7）。CCK8 實(shí)驗(yàn)顯示，SIRT6 組老年人成纖維細(xì)胞24 h 和48 h 增殖速度較對(duì)照組提高明顯（均P＜0.05）（圖8）。實(shí)時(shí)PCR顯示，SIRT6 組成纖維細(xì)胞Col 3、Itgβ1、Itgα3、Itgα5 mRNA 表達(dá)水平均顯著高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05），見(jiàn)表2。

五、SIRT6過(guò)表達(dá)對(duì)老年人成纖維細(xì)胞p?p65表達(dá)的影響

細(xì)胞感染后72 h Western 印跡檢測(cè)結(jié)果顯示，SIRT6 組老年人皮膚成纖維細(xì)胞p?p65 蛋白水平低于對(duì)照組（P＜ 0.05）。見(jiàn)圖6、表2。

討論

圖5 老年人皮膚成纖維細(xì)胞感染72 h 后倒置熒光顯微鏡觀(guān)察 對(duì)照組（感染空病毒）和SIRT6 組（感染SIRT6 慢病毒）老年人皮膚成纖維細(xì)胞中均可見(jiàn)綠色熒光蛋白表達(dá)

圖6 Western 印跡檢測(cè)老年人皮膚成纖維細(xì)胞感染SIRT6 慢病毒后p?p65蛋白水平的改變

圖7 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞感染后老年人成纖維細(xì)胞遷移能力的改變 劃痕24 h后，感染SIRT6慢病毒組老年人皮膚成纖維細(xì)胞較感染空病毒組劃痕寬度顯著下降

圖8 感染慢病毒后老年人皮膚成纖維細(xì)胞增殖活性的變化細(xì)胞感染SIRT6 慢病毒后24 h 和48 h，增殖活性顯著高于對(duì)照組。a：P ＜ 0.05

創(chuàng)面愈合分為炎癥、再上皮化和組織重塑3 個(gè)主要階段，在創(chuàng)面愈合中關(guān)鍵因素是修復(fù)細(xì)胞的增殖和遷移能力。成纖維細(xì)胞作為皮膚創(chuàng)面愈合中組織重塑的核心細(xì)胞，起到至關(guān)重要的作用［1?2］。SIRT6 是一種煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamideadenine dinucleotide）依賴(lài)的組蛋白去乙酰化酶，被證實(shí)可以抑制細(xì)胞衰老，并可以延長(zhǎng)小鼠壽命［5?7］。本研究顯示，隨著年齡增長(zhǎng)，人皮膚成纖維細(xì)胞形態(tài)學(xué)沒(méi)有發(fā)生顯著變化，但是SIRT6的表達(dá)降低，這與既往報(bào)道中SIRT6 在人成纖維細(xì)胞的表達(dá)隨年齡增加而降低的結(jié)果一致［7?8］。同時(shí)本研究還顯示，老年人皮膚成纖維細(xì)胞的增殖能力和遷移能力也有所降低。

為了探討SIRT6 的表達(dá)水平與成纖維細(xì)胞的增殖能力和遷移能力之間的關(guān)系，本實(shí)驗(yàn)感染SIRT6 基因至老年人成纖維細(xì)胞，使其SIRT6 表達(dá)增高，觀(guān)察其對(duì)細(xì)胞增殖能力和遷移能力的影響。結(jié)果證實(shí)，SIRT6 表達(dá)增高后，老年人成纖維細(xì)胞的增殖能力和遷移能力均明顯改善，提示SIRT6 可能對(duì)創(chuàng)傷愈合中的組織重塑起促進(jìn)作用，是改善皮膚創(chuàng)傷愈合的一個(gè)重要靶點(diǎn)。

表2 感染SIRT6慢病毒后老年人皮膚成纖維細(xì)胞中Col1、Col3、Itgβ1、Itgα3、Itgα5 mRNA以及SIRT6等蛋白表達(dá)變化（）

表2 感染SIRT6慢病毒后老年人皮膚成纖維細(xì)胞中Col1、Col3、Itgβ1、Itgα3、Itgα5 mRNA以及SIRT6等蛋白表達(dá)變化（）

注：n=4。SIRT6：沉默信息調(diào)節(jié)因子2 同源類(lèi)似物6；Col1：Ⅰ型膠原蛋白；Col3：Ⅲ型膠原蛋白；Itgβ1、Itgα3、Itgα5：整合素亞基β1、α3、α5。對(duì)照組：感染空病毒；SIRT6組：感染SIRT6慢病毒

組別對(duì)照組SIRT6組t值P值Col 1 mRNA 1.0±0.133 1.3±0.092 0.976 0.352 Col 3 mRNA 1.0±0.362 2.2±0.214 5.692 0.015 Itgβ1 mRNA 1.0±0.140 1.7±0.119 4.478 0.043 Itgα3 mRNA 1.0±0.427 3.1±1.372 5.321 0.033 Itgα5 mRNA 1.0±0.261 1.9±0.063 5.773 0.015 SIRT6 1.000±0.178 2.730±0.067 3.040 0.002 p?p65 1.000±0.062 0.634±0.179 2.949 0.015 p65 4.621±0.285 4.884±0.582 0.863 0.408

創(chuàng)傷愈合是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，多種因素參與其中，包括周?chē)渌?xì)胞、細(xì)胞因子、膠原蛋白等，SIRT6 如何影響成纖維細(xì)胞增殖和遷移能力，目前還不清楚。我們進(jìn)一步檢測(cè)成纖維細(xì)胞分泌的膠原蛋白、遷移能力相關(guān)的整合素等表達(dá)的變化。Col 1 主要存在于成熟組織中，Col 3 主要是新生的膠原蛋白，本研究中SIRT6 過(guò)表達(dá)后，Col 3 表達(dá)升高明顯，提示SIRT6 可能促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖使新生Col 3 增多，也可能是SIRT6 本身可以提高成纖維細(xì)胞Col 3 的分泌能力，還有待進(jìn)一步研究和證實(shí)。Rippa 等［9］報(bào)道創(chuàng)傷發(fā)生時(shí)，成纖維細(xì)胞會(huì)上調(diào) Itgα5β1 和 α3β1 的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞向創(chuàng)傷區(qū)域遷移。本研究中 SIRT6 過(guò)表達(dá)后Itgβ1、Itgα3、Itgα 5 mRNA 水平增高，提示SIRT6 可能通過(guò)上調(diào)整合素表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞遷移。

NF?κB 參與細(xì)胞的多種生物學(xué)過(guò)程，其中包括衰老過(guò)程，目前研究普遍認(rèn)為，NF?κB 是衰老相關(guān)的分泌表型，可以促進(jìn)細(xì)胞的衰老。本研究中SIRT6 過(guò)表達(dá)后，NF?κB 亞基 p?p65 表達(dá)下降，遷移能力和增殖能力升高，提示SIRT6 可能通過(guò)抑制NF?κB 通路，提高老年人皮膚成纖維細(xì)胞的遷移和增殖能力，達(dá)到抗衰老的目的。有研究證實(shí)，SIRT6可以通過(guò)抑制 NF?κB 通路，延長(zhǎng)小鼠壽命［6］。Goyarts 等［10］也發(fā)現(xiàn)，SIRT6 表達(dá)下調(diào)后 NF?κB 表達(dá)增多。本研究結(jié)果與上述結(jié)論一致。

綜上，SIRT6 可能通過(guò)抑制 NF?κB 通路從而促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖和遷移，但是NF?κB通路如何影響細(xì)胞增殖和遷移，與下游的哪些基因和通路有關(guān)均有待進(jìn)一步研究。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突