顧潔 殷江文 張夢潔 繆紅軍 李軍

膿毒癥是指機(jī)體對感染的反應(yīng)失調(diào)而引起的、危及生命的多器官功能障礙，進(jìn)一步發(fā)展可引起全身各器官功能衰竭及休克[1]。該病發(fā)生率逐年上升，病情兇險(xiǎn)，病死率高[2]。目前尚無治療嚴(yán)重膿毒癥及膿毒癥休克的特效藥物。因此，早期診斷與治療是關(guān)鍵。關(guān)于膿毒癥新診斷標(biāo)志物的探索，一直是研究的熱點(diǎn)[3]。腱糖蛋白C（tenascin-C，TNC）是一種細(xì)胞外基質(zhì)糖蛋白，是腱糖蛋白家族的重要一員。它參與多種生物胚胎發(fā)育過程，同時(shí)參與炎癥、組織損傷、腫瘤血管生成和轉(zhuǎn)移等病理過程[4]。感染和損傷可誘導(dǎo)TNC表達(dá)，從而促進(jìn)機(jī)體產(chǎn)生對細(xì)菌脂多糖（LPS）的免疫應(yīng)答效果。TNC能使巨噬細(xì)胞在LPS激活Toll樣受體4（TLR4）時(shí)，促進(jìn)促炎細(xì)胞因子的翻譯并抑制抗炎細(xì)胞因子的合成，在介導(dǎo)TLR4信號(hào)途徑調(diào)節(jié)炎癥表達(dá)中起關(guān)鍵作用[5]。TNC的表達(dá)可能與膿毒癥發(fā)生、發(fā)展過程中的炎癥反應(yīng)存在相關(guān)性。因此，本研究觀察了膿毒癥小鼠多種重要臟器組織及RAW264.7單核巨噬細(xì)胞經(jīng)LPS處理后不同時(shí)點(diǎn)TNC表達(dá)情況，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物分組和建模 將30只SPF級、6～8周齡、體重18～20g的C57BL/6小鼠（南京醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心）按隨機(jī)數(shù)字表法分成2組，即對照組（Sham組）和盲腸結(jié)扎穿孔組[6]（CLP組），每組15只。膿毒癥CLP建模：術(shù)前6h禁食、3h禁飲，腹腔注射4%水合氯醛（0.1ml/10g）麻醉后，沿腹正中線作1cm左右的縱向切口，暴露腹腔分離并找到盲腸，將盲腸結(jié)扎穿刺，擠出少許腸內(nèi)容物，然后將盲腸回納后關(guān)閉腹腔，皮下注射37℃的0.9%氯化鈉溶液后復(fù)蘇。術(shù)后24h頸椎脫臼法處死小鼠，取重要臟器組織作相應(yīng)檢測。

1.2 小鼠肺組織病理檢查 （1）HE染色：取小鼠肺組織，以4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，HE染色切片，在顯微鏡下觀察拍照。（2）免疫組化染色：將剩余石蠟塊脫蠟、脫水，行免疫組化染色，棕黃色為TNC陽性表達(dá)，在光學(xué)顯微鏡下觀察小鼠肺組織TNC陽性表達(dá)情況。同時(shí)計(jì)算陽性累計(jì)光密度值（IOD），即TNC陽性表達(dá)水平。

1.3 小鼠血清TNC水平檢測 采用酶聯(lián)免疫吸附法。從小鼠心臟大血管中取血，3 000g離心15min留取血清；嚴(yán)格按照試劑盒（購于武漢EIAab公司）說明書進(jìn)行操作，雙抗體夾心法檢測血清TNC水平，所有樣品設(shè)復(fù)孔，并在同一批次內(nèi)完成。

1.4 小鼠肝、心、肺、腎組織TNC mRNA表達(dá)檢測 采用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)法。取小鼠肝、心、肺、腎組織樣本各稱取30mg，加入Trizol試劑500μl，充分勻漿，使組織充分裂解；加入 Trizol試劑 500μl和氯仿 200μl，震蕩混勻至粉紅色，靜置5min，4℃ 12 000g離心15min，轉(zhuǎn)移上清液至新的無酶EP管；加入等體積異丙醇，充分混勻，室溫下靜置10min，4℃ 12 000g離心10min，棄上清液；加入預(yù)冷的75%無水乙醇1ml洗滌沉淀，4℃ 7 500g離心5min，棄上清液，干燥；根據(jù)沉淀量的多少加入DEPC水20～30μl，4℃冰箱過夜充分溶解。使用One Drop分光光度計(jì)測定RNA樣品OD260/OD280比值及濃度，均在1.80～2.00則表示RNA純度較高。使用HiSCRiptⅡQ RT SuperMix配置逆轉(zhuǎn)錄體系將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。按照SYBR qPCR Master Mix配置反應(yīng)體系，預(yù)變性 95℃ 30s，循環(huán)反應(yīng) 95℃ 10s，60℃ 30s，40 個(gè)循環(huán)；熔解曲線 95℃ 15s，60℃ 60s，95℃ 15s。根據(jù) CT 值分析，使用內(nèi)參基因GAPDH計(jì)算TNC mRNA相對表達(dá)量。根據(jù)文獻(xiàn)設(shè)計(jì)小鼠TNC和GAPDH引物（由南京一道生物科技有限公司合成），見表1。

表1 小鼠TNC基因及內(nèi)參引物序列

1.5 體外細(xì)胞培養(yǎng)及處理 將小鼠腹腔巨噬細(xì)胞RAW264.7（購于美國ATCC公司）接種在含10%胎牛血清+青霉素100U/ml+鏈霉素100μg/ml的DMEM培養(yǎng)基中，置于含5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞生長至70%～80%后進(jìn)行傳代，2～3d傳代1次，取對數(shù)生長期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)分為2組，即空白對照組（Con組）、LPS組。RAW264.7細(xì)胞培養(yǎng)在6孔板中，每孔2ml，加入濃度100ng/ml的 LPS 進(jìn)行處理；分別在 0、2、4、8、12、24h 收集細(xì)胞及上清液，同時(shí)Trizol試劑提取總RNA，以備檢測。

1.5.1 細(xì)胞上清液腫瘤壞死因子α（TNF-α）及TNC水平檢測 采用酶聯(lián)免疫吸附法，具體方法同1.3。

1.5.2 細(xì)胞中TNC mRNA表達(dá)檢測 采用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)法，具體方法同1.4。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 21.0、Graphpad Prime 7.0統(tǒng)計(jì)軟件。樣品平行重復(fù)檢測3次取平均值，計(jì)量資料用表示，兩組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用重復(fù)測量數(shù)據(jù)的方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組小鼠一般情況比較 Sham組小鼠術(shù)后一般情況尚可，可正?；顒?dòng)，無死亡；CLP組小鼠術(shù)后精神萎靡，心率、呼吸增快，可見口唇發(fā)紺，術(shù)后12h出現(xiàn)第1只小鼠死亡，18h后死亡只數(shù)增加，至24h處死時(shí)共死亡5只；它們死前均有體溫下降、口唇發(fā)紺，破腹后可見腹腔有渾濁滲出液、腸道粘連、盲腸壞死，考慮死因?yàn)楦腥拘孕菘恕?/p>

2.2 兩組小鼠肺組織HE染色及免疫組化染色比較HE染色見CLP組小鼠肺組織損傷較Sham組嚴(yán)重，肺泡明顯擴(kuò)張、塌陷，炎癥細(xì)胞大量浸潤，進(jìn)一步說明造模成功，見圖1（插頁）。免疫組化染色見CLP組小鼠肺組織TNC陽性表達(dá)，棕黃色染色明顯沉積于肺泡毛細(xì)血管內(nèi)，且多分布在肺泡隔中大量浸潤的炎癥細(xì)胞周圍；而對照組小鼠肺組織中僅少量表達(dá)，見圖2（插頁）。CLP組肺組織TNC表達(dá)水平為3 231±518，明顯高于Sham組的 1 429±328.2，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖1 兩組小鼠肺組織HE染色所見（a：CLP組；b：Sham組；×10）

圖2 兩組小鼠肺組織抗TNC免疫組化染色所見（a：CLP組；b：Sham 組；×20）

2.3 兩組小鼠血清TNC水平及重要臟器組織TNC mRNA表達(dá)比較 CLP組小鼠血清TNC水平為（15.74±0.45）ng/ml，明顯高于 Sham 組的（8.0±0.51）ng/ml，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與Sham組比較，CLP組小鼠心、肺、腎組織TNC mRNA相對表達(dá)量均明顯增高，肝組織TNC mRNA相對表達(dá)量明顯減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均 P＜0.05），見表 2。

表2 兩組小鼠重要臟器組織TNC mRNA相對表達(dá)量比較

2.4 LPS對細(xì)胞上清液TNF-α、TNC水平及細(xì)胞中TNC mRNA表達(dá)的影響 Con組幾乎不表達(dá)TNF-α，而LPS組細(xì)胞上清液TNF-α濃度明顯升高，提示LPS成功誘導(dǎo)小鼠膿毒癥細(xì)胞模型。100ng/ml的LPS處理RAW264.7細(xì)胞后，各時(shí)點(diǎn)細(xì)胞上清液TNC水平及細(xì)胞中mRNA相對表達(dá)量比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；呈一定的時(shí)間依賴，8h達(dá)峰值，見表3。

3 討論

常見的小鼠膿毒癥模型有CLP宿主屏障破壞模型、尾靜脈注射LPS的膿毒血癥模型和腹腔注射活病原體的細(xì)菌感染模型。而本實(shí)驗(yàn)選擇CLP造模，能相對模擬機(jī)體炎癥、血流動(dòng)力學(xué)及免疫反應(yīng)等過程[7]。實(shí)驗(yàn)組前期發(fā)現(xiàn)CLP術(shù)后6h小鼠開始出現(xiàn)癥狀，24h炎癥反應(yīng)最明顯[8]，因此本實(shí)驗(yàn)選擇術(shù)后24h留取標(biāo)本。巨噬細(xì)胞的異常活化在膿毒癥、膿毒癥休克以及其導(dǎo)致的多器官功能衰竭等病理過程中起著關(guān)鍵作用。細(xì)菌的LPS大部分通過與TLR4結(jié)合介導(dǎo)的髓樣分化因子88途徑，使巨噬細(xì)胞活化，進(jìn)而發(fā)生炎癥級聯(lián)失控瀑布效應(yīng)[9]。因此，本實(shí)驗(yàn)還選擇了同源性的小鼠單核巨噬細(xì)胞RAW264.7，觀察經(jīng)LPS處理后不同時(shí)點(diǎn)TNC表達(dá)情況。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TNC的表達(dá)呈一定的組織及時(shí)間特異性。CLP小鼠血清TNC水平較Sham組明顯增加，重要臟器組織TNC mRNA表達(dá)較Sham組也有差異，其中心、肺、腎組織TNC表達(dá)明顯增加，肝組織TNC表達(dá)減少。小鼠腹腔巨噬細(xì)胞RAW264.7在LPS刺激后，細(xì)胞中TNC mRNA表達(dá)明顯增加，隨著時(shí)間推移不斷增高，呈一定的時(shí)間依賴。

TNC是一種大分子基質(zhì)蛋白，具有促進(jìn)細(xì)胞遷移、細(xì)胞黏附、前炎癥因子合成及血管重塑等作用。它在正常人體組織中極少表達(dá)或不表達(dá)，當(dāng)組織損傷后表達(dá)增高。TNC在腫瘤組織中高表達(dá)，因此是目前腫瘤疾病研究的熱點(diǎn)。Yuan等[10]對167例ICU膿毒癥患者24h血TNC水平進(jìn)行檢測，同時(shí)觀察了30d死亡情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)TNC水平較高的58例患者在30d內(nèi)死亡；可見，膿毒癥患者TNC水平升高與預(yù)后差有關(guān)。Uddin等[11]使用100ng/ml的LPS刺激小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在處理8h后細(xì)胞上清液TNC水平及mRNA表達(dá)最高，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致；同時(shí)發(fā)現(xiàn)一氧化碳釋放分子2（CORM-2）可明顯降低LPS誘導(dǎo)的TNC、促炎細(xì)胞因子表達(dá)，同時(shí)增加白細(xì)胞介素10表達(dá)；還發(fā)現(xiàn)TNC siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞能顯著抑制LPS刺激細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子，CORM-2調(diào)節(jié)白細(xì)胞介素10表達(dá)并在體內(nèi)外抑制TNC介導(dǎo)的炎癥表達(dá)。

綜上所述，在膿毒癥炎癥發(fā)展過程中，TNC呈現(xiàn)一定的組織及時(shí)間特異性，可作為早期診斷膿毒癥的潛在生物標(biāo)志物。

表3 LPS對細(xì)胞上清液TNF-α、TNC水平及細(xì)胞中TNC mRNA表達(dá)的影響