張軍華 黃 蓉 陳 賽 桂 嶸

（中南大學湘雅三醫(yī)院輸血科 長沙410000）

有研究發(fā)現(xiàn)骨髓間充質(zhì)干細胞（Bone marrow mesenchymal stem cell， BMMSC）和外周血受一定劑量的X 射線照射后，會造成細胞內(nèi)DNA 損傷［1-2］。當DNA 損傷時，P53 表達量升高并被激活。根據(jù)DNA 損傷程度，P53 通過增強其下游多種基因的轉(zhuǎn)錄而引起細胞周期阻滯、凋亡或衰老，從而維持細胞基因組的完整性［3］?？梢姡琍53通路是機體應(yīng)對DNA損傷的天然防護屏障，然而目前P53發(fā)揮作用的上游調(diào)控機制尚不清楚。本研究將在國內(nèi)外相關(guān)研究基礎(chǔ)上，在BMMSC 內(nèi)，通過circRNA 層面探討P53 激活的上游機制，為P53 激活的上游信號調(diào)控網(wǎng)絡(luò)打開一個全新的思路，豐富和完善P53通路調(diào)控BMMSC放射抗性的機制。

1 材料與方法

1.1 主要材料

Balb/c 雌性小鼠BMMSC（上海中國科學院細胞庫）；間充質(zhì)干細胞（MSC）完全培養(yǎng)基（友康恒業(yè)生物科技（北京）有限公司）；胎牛血清（Gibco，美國）；mmu-circRNA-017122 和miRNA-29 引物（上海吉凱基因化學技術(shù)有限公司）；p53目的野生型基因序列和突變序列（上海吉凱基因化學技術(shù)有限公司）；熒光素酶報告基因野生型以及突變型載體和引物由上海生工生物工程有限公司合成；全自動凝膠成像分析儀（BIO-RAD，美國）；多功能酶標儀（BioTek，美國）；直線加速器（Varian Unique，美國）。

1.2 方法

1.2.1 吸收劑量對mmu-circRNA_017122的影響

BMMSC 濃度調(diào)整至2×106mL-1，接種于6 孔細胞培養(yǎng)板中，培養(yǎng)至細胞匯合率達80%左右時，將細胞分成5組，在直線加速器的X射線輻射場中進行照射處理，劑量率為0.4 Gy/min，源靶距100 cm，累積劑量分別為2 Gy、4 Gy、6 Gy 和8 Gy，對照組做遮擋處理，繼續(xù)于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h、12 h、18 h、24 h、30 h 和36 h，qRT-PCR 檢 測mmucircRNA_017122 和mmu-miR-29b-2-5p 的表達量，并用酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）檢測P53 相對表達量。

1.2.2 生物學功能預測

分別利用TargetScan 和miRanda 預測mmucircRNA_017122 與miRNA 的結(jié)合位點，生成circRNA-miRNA 關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖，選取其中5 個匹配值最高的miRNA，利用KEGG 軟件對其進行相關(guān)生物信息學分析。

1.2.3 熒光素酶報告基因?qū)嶒?/p>

生物信息學軟件預測mmu-circRNA_017122與mmu-miR-29b-2-5p 3′端 非 翻 譯 區(qū)（3′untranslated region，3′UTR）的結(jié)合位點，設(shè)計合成包含mmucircRNA_017122 結(jié) 合 序 列 的mmu-miR-29b-2-5p 重組螢火蟲熒光素酶報告質(zhì)粒，將帶有海腎熒光素酶基因的質(zhì)粒（pRL-TK）作為對照質(zhì)粒與報告基因質(zhì)粒、mmu-circRNA_017122 mimic 和mmucircRNA_017122抑制劑共轉(zhuǎn)染BMMSC，24 h后檢測螢火蟲熒光素酶（FL）和海腎熒光素酶（RL）的活性，根據(jù)FL/RL分析mmu-circRNA_017122與mmu-miR-29b-2-5p特異性結(jié)合。

1.2.4 RNA pull-down 試驗驗證mmu-miR-29b-2-5p與p53特異性結(jié)合

分別提取mmu-miR-29b-2-5p 腺病毒轉(zhuǎn)染組、空白對照組和mmu-miR-29b-2-5p 干擾組的BMMSC 中的總RNA。將200 pmol 生物素標記的p53與500 μg親和素標記的磁珠混合溫浴一段時間后，加入100 μg 上述總RNA 溫浴。形成RNARNA 復合物，該復合物可與鏈霉親和素標記的磁珠結(jié)合，從而與孵育液中的其他成分分離。將磁珠上結(jié)合的RNA 洗脫下來后，對mmu-miR-29b-2-5p進行實時熒光定量PCR定量檢測。

1.2.5 mmu-miR-29b-2-5p調(diào)控P53的表達量

分別使用直線加速器照射mmu-miR-29b-2-5p腺病毒轉(zhuǎn)染組、空白對照組和mmu-miR-29b-2-5p干擾組的BMMSC，吸收劑量為4 Gy，源靶距100 cm，吸收劑量率0.4 Gy/min。37°C、5%CO2繼續(xù)培養(yǎng)，分別于照射后6 h、12 h、18 h、24 h、30 h 和36 h收取細胞，提取總RNA，檢測mmu-miR-29b-2-5p和mmu-circRNA_017122表達量，并用酶聯(lián)免疫吸附測定法（ELISA）檢測各組BMMSC 內(nèi)P53 的表達水平。

1.2.6 mmu-circRNA_017122 通 過 P53 參 與BMMSC輻照損傷修復

使用直線加速器分別對mmu-circRNA_017122腺病毒、空白腺病毒和siRNA-mmu-circRNA_017122 轉(zhuǎn)染的p53 野生型和p53 缺失型BMMSC 及對照細胞以4 Gy 照射，源靶距100 cm，吸收劑量率0.4 Gy/min。37°C、5%CO2繼續(xù)培養(yǎng)，分別于照射后6 h、12 h、18 h、24 h、30 h和36 h收取細胞，檢測P53的表達水平。使用Cell Counting Kit-8（CCK-8）測定法測量細胞增殖指數(shù)。每次待處理孔中加入10 μL CCK-8 溶液，置于37°C 恒溫箱中2 h，然后置于酶標儀器上，于450 nm波長處測定各樣本OD值，每個時間點對每組細胞測試5個孔。

2 統(tǒng)計分析

3 結(jié)果

3.1 吸收劑量對mmu-circRNA_017122的影響

輻照處理小鼠BMMSC 后，用qRT-PCR 分別檢測于0 Gy、2 Gy、4 Gy、6 Gy 和8 Gy 處理組培養(yǎng)6 h、12 h、18 h、24 h、30 h 和36 h 后mmumiR-29b-2-5p 和mmu-circRNA_017122 的 表 達 水平。結(jié)果顯示，當吸收劑量為2 Gy、4 Gy 和6 Gy時，mmu-miR-29b-2-5p 表達無明顯差異，mmucircRNA_017122 和P53 表達水平明顯升高，且各組間具有顯著差異，不同吸收劑量組培養(yǎng)不同時間后mmu-circRNA_017122 和P53 表達水平也有顯著差異，8 Gy 組細胞在12 h 開始出現(xiàn)脫落死亡，mmu-circRNA_017122 和P53 表達水平改變不明顯（圖1）。

3.2 生物學功能預測

運用miRanda、TargetScan 軟件，根據(jù)與目標序列上MREs 的miRNA 覆蓋度，得到符合要求的ceRNA 關(guān)系對。將過濾后的ceRNA 按照其競爭結(jié)合的強弱進行排序，以網(wǎng)絡(luò)圖的形式展現(xiàn)circRNA-miRNA-mRNA 的 三 元 關(guān) 系。 使 用Cytoscape v 2.8.3 軟件繪制ceRNA 關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖?？梢妋mu-circRNA_017122 與mmu-miR-29b-2-5p 之間的內(nèi)源性競爭關(guān)系（ceRNA機制）（圖2），具體結(jié)合位點見圖3。

3.3 熒光素酶檢測報告基因檢測證實mmucircRNA_017122和mmu-miR-29b-2-5p特異性結(jié)合

采用熒光素酶活性檢測mmu-circRNA_017122與mmu-miR-29b-2-5p 是否具有特異性結(jié)合，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，mmu-circRNA_017122 模擬物與含有mmumiR-29b-2-5p序列的重組螢火蟲熒光素酶報告質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染BMMSC，和空白對照組相比，熒光素酶活性強度明顯降低，且差異具有統(tǒng)計學意義（p＜0.05）；mmu-circRNA_017122 siRNA干擾組與含有mmu-miR-29b-2-5p 序列的重組螢火蟲熒光素酶報告質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染BMMSC，和空白對照組相比，共轉(zhuǎn)染組BMMSC內(nèi)熒光素酶強度活性明顯增強，差異具有統(tǒng)計學意義（p＜0.05）（圖4），這說明mmu-circRNA_017122 與mmu-miR-29b-2-5p 可 以特異性結(jié)合。

3.4 RNA pull-down 試驗驗證mmu-miR-29b-2-5p與p53特異性結(jié)合

實時熒光定量定量檢測從磁珠上洗脫下來的mmu-miR-29b-2-5p，發(fā)現(xiàn)mmu-miR-29b-2-5p 腺病毒轉(zhuǎn)染組、空白對照組和mmu-miR-29b-2-5p 干擾組中mmu-miR-29b-2-5p 表達水平具有顯著差異，具有統(tǒng)計學意義（p＜0.05）（圖5）。

3.5 mmu-miR-29b-2-5p調(diào)控P53的表達量

mmu-miR-29b-2-5p 腺病毒轉(zhuǎn)染組、空白對照組和mmu-miR-29b-2-5p 干擾組的BMMSC 分別進行照射處理后，分別于6 h、12 h、18 h、24 h、30 h和36 h收取各組細胞，qRT-PCR和ELISA檢測法分別檢測各組BMMSC mmu-circRNA_017122 和P53 的表達水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，mmu-circRNA_017122 表達量僅受輻照影響（圖1（a）），mmumiR-29b-2-5p腺病毒轉(zhuǎn)染組接受輻照處理后P53表達量比未接受輻照處理組下降更顯著；而mmumiR-29b-2-5p 干擾組與對照組相比，P53 相對表達量升高更顯著（圖6）。

3.6 mmu-circRNA_017122 通 過 p53 參 與BMMSC輻照損傷修復

將 siRNA-mmu-circRNA_017122、 scramble siRNA、過表達重組mmu-circRNA_017122 腺病毒以及空白腺病毒分別轉(zhuǎn)染p53野生型組和p53缺失型組BMMSC 后，分別在37°C 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，用ELISA 試劑盒檢測各組細胞P53 表達水平，與p53 缺失型組比較，p53 野生型組過表達重組mmu-circRNA_017122 腺病毒轉(zhuǎn)染BMMSC 后P53表達水平增加，而siRNA-mmu-circRNA_017122組細胞P53表達水平顯著下降，具有統(tǒng)計學意義（圖7）。同時將上述各處理組分別在37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h、12 h、18 h、24 h、30 h 和36 h 后，通過CCK-8試劑盒檢測各處理組在450 nm吸光光度值，分析其細胞增殖情況，發(fā)現(xiàn)p53 野生型組siRNAmmu-circRNA_017122 組細胞490 nm 吸光光度值顯著降低，而過表達重組mmu-circRNA_017122腺病毒轉(zhuǎn)染p53 野生型BMMSC 增殖明顯，這說明mmu-circRNA_017122 通 過P53 參 與BMMSC 輻 照損傷修復，并促進細胞增殖（p＜0.05，圖8）。

4 討論

BMMSC 是造血微環(huán)境的重要組成部分［4-5］。其功能主要是分泌多種細胞因子調(diào)節(jié)造血干細胞增殖分化［6］，在造血干細胞移植術(shù)中，BMMSC是移植能否成功的關(guān)鍵因素。研究表明，BMMSC分泌黏附因子加快造血干細胞歸巢［7］，并且支持內(nèi)皮細胞增殖遷移，參與微血管形成［8］。有研究發(fā)現(xiàn)BMMSC與造血干細胞共移植可促進移植后的造血重建，使機體造血功能恢復明顯加快［9］。

患者在造血干細胞移植前一般須進行全身輻照預處理，以清除病變造血干細胞。然而在此過程中，輻照也會對BMMSC 造成一定程度的損傷，導致部分受者移植后造血重建延遲，造血恢復緩慢，移植后感染等發(fā)生率增加，甚至可能導致移植失敗［10］。因此，在造血干細胞移植前全身輻照預處理或放射治療中，如何最大限度地保證BMMSC的數(shù)量和質(zhì)量對骨髓損傷后的造血恢復意義重大［11］，增強BMMSC 的放射抗性是臨床亟待解決的問題。

P53是細胞內(nèi)的一個強大的轉(zhuǎn)錄因子，正常情況下，p53 基因及其相關(guān)網(wǎng)絡(luò)處于關(guān)閉狀態(tài)，當細胞在DNA 損傷時可被快速激活，通過增強其下游多種基因的轉(zhuǎn)錄而引起細胞周期阻滯、凋亡或衰老，保持細胞基因組的完整性并清除損傷細胞［12］。另外，P53與自噬的發(fā)生緊密相關(guān)，細胞放射損傷時P53 被激活，可使mTOR 抑制，自噬小體形成和LC3 脂化、斷裂，引起自噬的發(fā)生［13］?？梢?，P53 介導的DNA 損傷反應(yīng)的快速啟動以及細胞自噬是BMMSC放射耐受的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，對這一機制的深入研究可為細胞放射抵抗和放射耐受提供重要的信息。

已 有 研 究［14-16］表 明，miR-29 家 族 的3 個miRNA（miR-29a、miR-29b 和miR-29c）可促進P53的應(yīng)激反應(yīng)。我們前期通過circRNA芯片篩選到了mmu-circRNA_017122 在放射損傷的BMMSC中的異常表達，生物信息學技術(shù)預測該circRNA可與mmu-miR-29b-2-5p 配對結(jié)合，且初步使用siRNA 干擾技術(shù)證實沉默該circRNA 后mmu-miR-29b-2-5p 顯著上調(diào)［17］。證實mmu-circRNA_017122與mmu-miR-29b-2-5p 之間的內(nèi)源性競爭關(guān)系（ceRNA機制），利用miRanda和TargetScan算法進行ceRNA 分析得到circRNA-miRNA-mRNA 網(wǎng)絡(luò)圖，我們提出科學假設(shè)：BMMSC 中存在具有mmu-miR-29b-2-5p 應(yīng)答元件的mmu-circRNA_017122，當BMMSC 遭受放射損傷時，mmucircRNA_017122 可通過“海綿作用”吸附mmumiR-29b-2-5p，調(diào)節(jié)P53的表達，從而參與DNA損傷反應(yīng)或細胞自噬，影響B(tài)MMSC的放射抗性。

本研究通過熒光素酶檢測報告基因檢測證實mmu-circRNA_017122 和mmu-miR-29b-2-5p 特 異性結(jié)合，并利用RNA pull-down 試驗驗證mmumiR-29b-2-5p與P53特異性結(jié)合，利用不同劑量輻照處理BMMSC，并于不同時間點分別檢測mmucircRNA_017122、P53 和細胞增殖情況，發(fā)現(xiàn)mmu-circRNA_017122、P53 和細胞增殖均受吸收劑量影響。進一步檢測mmu-miR-29b-2-5p干擾組、mmu-circRNA_017122 干擾組和空白對照組中各相關(guān)指標檢測和細胞增殖情況，檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，空白對照組BMMSC 內(nèi)mmu-circRNA_017122 和P53的表達均顯著升高，細胞增殖明顯；mmu-miR-29b-2-5p干擾組較對照組P53顯著升高，細胞明顯增殖；mmu-circRNA_017122干擾組經(jīng)4 Gy輻照處理后，P53雖有升高，但與對照組比較，升高值無明顯統(tǒng)計學意義，細胞生長緩慢；P53過表達組細胞增殖顯著。

綜合上述，當BMMSC接受一定劑量的輻射處理時，胞內(nèi)mmu-circRNA_017122 表達量顯著上升，同時負性調(diào)控mmu-miR-29b-2-5p 對P53 表達的影響，從而促進BMMSC 增殖。這為深入研究BMMSC放射損傷的調(diào)控機制，進一步闡明放射生物學效應(yīng)的分子機制，并為造血干細胞移植患者的輻照損傷防護和救治提供了新的藥物靶點。