李 蕭，王 淼

江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214122

細(xì)菌纖維素(Bacterial Cellulose，BC)，是醋酸菌分泌合成的胞外多糖，由葡萄糖單體分子以β-1，4-糖苷鍵聚合而成的高分子聚合物，是一種天然形成的最細(xì)纖維[1，2]。與植物纖維素相比，BC具有均一性好、純度高等[3]特點(diǎn)，可廣泛用于醫(yī)療、影像器材、食品等眾多領(lǐng)域[4]。如今，合成生物學(xué)的發(fā)展使模型微生物可以用模塊化的DNA代碼進(jìn)行編程，以便執(zhí)行各種各樣的操作來(lái)達(dá)到目的[5]。這種方法可以通過(guò)基因調(diào)控來(lái)對(duì)BC合成進(jìn)行更精細(xì)的調(diào)控。然而，關(guān)于BC生產(chǎn)菌株的基因信息較少，相關(guān)的基因改造幾乎沒(méi)有[6]。因此，獲取各種BC生產(chǎn)菌株的基因組信息至關(guān)重要。

到目前為止，幾種產(chǎn)BC的Gluconacetobacter和Komagataeibacter已被測(cè)序，如G.xylinusE25[7]，K.medellinensisNBRC 3288[8]，K.nataicolaRZS01[9]和GluconobacteroxydansDSM 3504。其中Gluconacetobacterxylinus(又稱(chēng)Acetobacterxylinum)是最常被研究的物種之一，因?yàn)樗梢詮母黝?lèi)的碳、氮源中產(chǎn)生大量的BC[10-12]，對(duì)Komagataeibacter的研究較少。在本研究中，我們首先提出了K.rhaeticus315的完整基因組序列，為后續(xù)基因工程提供背景信息，后續(xù)可在代謝途徑的基礎(chǔ)上實(shí)現(xiàn)對(duì)BC生物合成的精確控制。其次，結(jié)合基因組序列，本研究對(duì)K.rhaeticus315的代謝途徑及代謝物進(jìn)行分析。最后，本研究通過(guò)對(duì)K.rhaeticus315進(jìn)行分子改造，將葡萄糖合成葡萄糖酸途徑中的關(guān)鍵酶-葡萄糖脫氫酶的相關(guān)基因敲除，使葡萄糖主要流向BC合成途徑，降低副產(chǎn)物的生成。

1 材料與方法

1.1 菌種與培養(yǎng)基

萊蒂亞駒形桿菌(Komagataeibacterrhaeticus)3-15：本實(shí)驗(yàn)室從紅茶菌中篩選并保藏。保藏號(hào)：CCTCC NO: M2016213。

種子培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖20、蛋白胨5、酵母粉5、Nacl 5，115 ℃滅菌20 min后室溫保存待用(固體培養(yǎng)基另加2%瓊脂)。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖30、蛋白胨5、酵母粉5、2%(v/v)無(wú)水乙醇，115 ℃滅菌20 min后室溫保存待用。

圖1 細(xì)菌纖維素生物合成途徑

1.2 試劑與設(shè)備

用于PCR反應(yīng)的2×PrimeSTAR Max DNA高保真聚合酶、2×Taq低保真聚合酶均購(gòu)買(mǎi)于寶生生物有限公司(大連，中國(guó))；Ezup柱式細(xì)菌基因組小量提取試劑盒、卡那青霉素(Km)以及瓊脂糖均購(gòu)于上海生工；標(biāo)準(zhǔn)樣品葡萄糖酸(GA)和乙酸購(gòu)自Sigma-Aldrich有限公司(美國(guó))；Tryptone、Yeast Extract夠買(mǎi)自O(shè)xoid公司(美國(guó))；Gold view、DNA Marker購(gòu)自廣州東盛生物科技有限公司(廣州，中國(guó))；其他所需試劑均為國(guó)產(chǎn)級(jí)分析純?cè)噭?/p>

PCR儀：美國(guó)Bio-Rad公司；DYY-60D 型核酸電泳儀：北京六一電泳儀廠；Gel Doc 凝膠成像系統(tǒng)：美國(guó)Bio-Rad公司；蛋白核酸定量測(cè)定儀：美國(guó)Thermo scientific公司；高效液相安捷倫1260色譜儀：美國(guó)Agilent公司；高速低溫離心機(jī)：德國(guó)Eppendorf公司；恒溫?fù)u床：上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；ZXSD-B1160生化培養(yǎng)箱，上海智城分析儀器制造有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1DNA提取及序列分析

將菌體在種子培養(yǎng)基里活化完成后，取培養(yǎng)液5 mL，用試劑盒提取DNA，電泳檢測(cè)合格后，構(gòu)建測(cè)序文庫(kù)。取100 ng全基因組DNA，使用超聲波破碎儀將其隨機(jī)打斷成小于500 bp的片段，然后進(jìn)行末端修復(fù)，兩端加測(cè)序接頭，最后用P5和P7引物擴(kuò)增純化后目的片段。使用Agilent 2100生物分析儀檢測(cè)文庫(kù)質(zhì)量，并且檢測(cè)文庫(kù)濃度，用檢驗(yàn)合格的文庫(kù)進(jìn)行cluster制備和測(cè)序。取5 μg～10 μg高質(zhì)量的基因組DNA，隨機(jī)打斷成10 kb左右的片段(根據(jù)基因組大小選擇20 kb文庫(kù))，隨后用DNA Template Prep試劑盒構(gòu)建SMRTbell文庫(kù)。結(jié)合測(cè)序引物和聚合酶，以自由擴(kuò)散的方式加入到PacBio Sequel平臺(tái)的測(cè)序芯片中，準(zhǔn)備測(cè)序。最后，對(duì)于質(zhì)檢合格的文庫(kù)，根據(jù)項(xiàng)目數(shù)據(jù)量要求進(jìn)行上機(jī)測(cè)序。

1.3.2基因組組裝與注釋

首先，基于第三代測(cè)序數(shù)據(jù)，使用HGAP4或Falcon軟件獲得初步裝配結(jié)果。然后，將經(jīng)過(guò)質(zhì)量篩選的第二代測(cè)序數(shù)據(jù)與裝配結(jié)果進(jìn)行對(duì)比，通過(guò)軟件Pilon對(duì)裝配結(jié)果進(jìn)行進(jìn)一步校正，得到最終的裝配結(jié)果。

基因功能注釋主要的方法來(lái)預(yù)測(cè)基因編碼蛋白序列與數(shù)據(jù)庫(kù)包含蛋白質(zhì)序列比對(duì)，如果某一個(gè)基因的蛋白質(zhì)序列和蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫(kù)中具有顯著的序列相似性，可以推斷出，基因和蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)中相同或相似的功能。根據(jù)編碼基因的預(yù)測(cè)蛋白序列，使用BLAST等比對(duì)軟件與數(shù)據(jù)庫(kù)中的蛋白序列進(jìn)行比對(duì)。序列比對(duì)值設(shè)置為1e-5，序列比對(duì)長(zhǎng)度不小于蛋白質(zhì)長(zhǎng)度的60%。選擇最優(yōu)匹配結(jié)果作為該基因的注釋結(jié)果。

1.3.3葡萄糖脫氫酶基因的敲除

(1) 感受態(tài)的制作

①將-80 ℃保存的醋酸桿菌K.rhaeticus315進(jìn)行平板劃線(xiàn)，待長(zhǎng)出單菌落后，挑取單菌落至3 mL種子培養(yǎng)基中過(guò)夜培養(yǎng)。

②取0.5 mL活化液接種至50 mL 種子培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至OD600=0.5～0.6時(shí)，即達(dá)到制備感受態(tài)的要求。

③將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)入無(wú)菌離心管中，冰浴10 min～15 min，于4 ℃，4 500×g離心10 min收集菌體。

④棄上清液，用1 mL預(yù)冷的0.1 mol/L氯化鈣溶液輕輕重懸菌體，于4 ℃，4 500×g離心10 min，棄上清。

⑤用1 mL預(yù)冷的超純水重懸菌體，于4 ℃，4 500×g離心10 min，棄上清。此步驟重復(fù)兩次。

⑥用1 mL 10%甘油重懸菌體，于4 ℃，4 500×g離心10 min，棄上清。

⑦按每管60 μL分裝至冰上預(yù)冷的1.5 mL無(wú)菌離心管中可直接使用或凍存于-80 ℃。

(2) 電脈沖轉(zhuǎn)化法

①將電脈沖杯從75%無(wú)水乙醇中取出，吹干，置于冰上預(yù)冷。

②從-80 ℃冰箱中取出感受態(tài)細(xì)胞，置于冰上融化后，加入10 μL片段。

③打開(kāi)電脈沖儀，設(shè)置好參數(shù)(電壓為2 kV)，將混有片段的感受態(tài)細(xì)胞加入到預(yù)冷的電脈沖杯里。

④將電脈沖杯放入電脈沖儀中，按下“開(kāi)始”按鈕，當(dāng)聽(tīng)到“?！钡囊宦暫?，立即取出電脈沖杯并迅速加入1 mL種子培養(yǎng)基，混勻。

⑤在30 ℃下緩慢振蕩培養(yǎng)2 h，取100 μL涂布到卡那抗性平板上，30 ℃倒置培養(yǎng)。

(3)gcd基因的構(gòu)建與克隆

根據(jù)gcd基因序列及km基因序列設(shè)計(jì)PCR引物，如表1所示。分別擴(kuò)增出gcd基因的上臂、km片段、下臂并將其連接起來(lái)，采用電脈沖法對(duì)K.rhaeticus315感受態(tài)進(jìn)行轉(zhuǎn)化后用驗(yàn)證引物驗(yàn)證是否轉(zhuǎn)化成功。

(4)gcd-重組菌株的發(fā)酵

將轉(zhuǎn)化成功的菌株進(jìn)行發(fā)酵，30 ℃下靜置培養(yǎng)4 d，測(cè)BC干重及葡萄糖酸濃度。

1.4 分析方法

1.4.1BC干重的測(cè)定[13]

表1 PCR引物序列

取發(fā)酵后的培養(yǎng)液，經(jīng)紗布過(guò)濾，將過(guò)濾后的BC用清水沖洗然后浸泡到1.5%(w/v)NaOH溶液中，80 ℃水浴2 h，用去離子水沖洗至pH中性，放入稱(chēng)量皿中，于105 ℃烘箱中烘干至恒重，稱(chēng)量，得BC的干重。

1.4.2殘?zhí)呛康臏y(cè)定

使用生物傳感分析儀對(duì)發(fā)酵液中的葡萄糖濃度進(jìn)行測(cè)定。

1.4.3葡萄糖酸、乙酸的測(cè)定

葡萄糖酸、醋酸的測(cè)定采用HPLC方法[14]。

樣品前處理：培養(yǎng)液離心后過(guò)0.22 μm水膜過(guò)濾，待測(cè)。色譜條件：高效液相色譜Agilent 1 260，檢測(cè)器為DAD，色譜柱：SB-AQ。流動(dòng)相：0.025 mol/L磷酸二氫鉀溶液，pH 2.5。流速：0.5 mL/min。檢測(cè)器波長(zhǎng)：210 nm，柱溫：30 ℃，進(jìn)樣量：10 μL。

1.5 數(shù)據(jù)處理分析

采用Origin 2016進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，結(jié)果用均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差來(lái)表示。

2 結(jié)果與討論

2.1 K.rhaeticus 315全基因組測(cè)序

K.rhaeticus315是新篩選的一株BC生產(chǎn)能力較強(qiáng)的菌株，為了最大程度的發(fā)揮BC生產(chǎn)菌株的生產(chǎn)能力，了解與BC合成相關(guān)的基因，本研究對(duì)K.rhaeticus315的全基因組進(jìn)行了測(cè)序注釋。如表2所示，K.rhaeticus315的基因信息被組裝成一條序列，總長(zhǎng)度為3.70 Mbp，平均覆蓋率為470X，GC含量63.98%。預(yù)測(cè)編碼DNA序列(CDS)數(shù)為3 314條。K.rhaeticus315基因組完整圈圖如圖2所示。

表2 K.rhaeticus 315基因組功能

圖3是菌株的蛋白質(zhì)功能圖。在K.rhaeticus315基因組中，包含25個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因、9個(gè)同工基因和37個(gè)透性酶基因。他們主要負(fù)責(zé)運(yùn)輸糖、糖酸、氨基酸、磷酸鹽、金屬離子和脂多糖等。K.rhaeticus315可以利用多種碳源去合成BC，最常見(jiàn)的為葡萄糖。一般情況下，葡萄糖會(huì)通過(guò)EMP途徑代謝。由于K.rhaeticus315基因組中缺乏編碼磷酸果糖激酶的基因(PFK；EC 2.7.1.11)，所以該菌株不能通過(guò)完整的EMP途徑去代謝葡萄糖供能。這與類(lèi)似菌株的研究結(jié)果一致[15，16]。此外，BC合成過(guò)程中另外兩個(gè)關(guān)鍵酶是葡萄糖激酶(glk)和丙酮酸激酶(pyk)均存在于K.rhaeticus315基因組中，它們的編碼基因座標(biāo)記為WP_019084814.1和WP_110095141.1。

圖2 K.rhaeticus 315基因組圈圖

圖3 蛋白質(zhì)功能的同源群(COG)分類(lèi)

戊糖磷酸途徑(PPP)是K.rhaeticus315中另一種有效的葡萄糖代謝途徑，在K.rhaeticus315基因組存在編碼PPP途徑中的關(guān)鍵酶基因：葡萄糖-6-磷酸脫氫酶的編碼基因是gcd(WP_110094965.1和WP_003620475.1)，6-磷酸葡糖酸內(nèi)酯酶的編碼基因是pgl(WP_110094851.1)，6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶的編碼基因是pgd(WP_110094848.1)，核糖磷酸3-表異構(gòu)酶的編碼基因是rpe(WP_110912266.1)，轉(zhuǎn)酮醇酶的編碼基因是tktA，tktB(K00615)。有編碼三羧酸循環(huán)(TCA)中三個(gè)關(guān)鍵酶的基因：檸檬酸合酶(K01647)，異檸檬酸脫氫酶(K00031，K00030)，2-氧戊二酸脫氫酶(K00164，K00658)。所以K.rhaeticus315可以通過(guò)PPP和TCA途徑進(jìn)行代謝來(lái)維持菌體生長(zhǎng)和BC合成。

2.2 代謝產(chǎn)物分析

據(jù)報(bào)道，碳源是影響B(tài)C產(chǎn)量和結(jié)構(gòu)差異的主要因素之一[17]。本研究發(fā)現(xiàn)K.rhaeticus315可以較好的利用葡萄糖、甘油和甘露醇，且三種碳源所合成的BC產(chǎn)量相似(圖4a)。菌株對(duì)果糖的利用不好，從基因組中分析，由于不存在編碼果糖激酶的基因(frk)，所以果糖無(wú)法被轉(zhuǎn)化為果糖-6-磷酸以及6-磷酸-葡萄糖。K.rhaeticus315對(duì)于雙糖的利用也不佳，主要是因?yàn)镵.rhaeticus315基因組中缺乏編碼蔗糖酶、麥芽糖酶等雙糖酶的基因。由于該菌株不具備EMP途徑，菌體主要通過(guò)PPP途徑和TCA途徑來(lái)代謝碳源。此時(shí)碳源流向三個(gè)途徑：菌體生長(zhǎng)代謝、合成BC、合成酸類(lèi)副產(chǎn)物。從圖4b可以看出，發(fā)酵20 d后，耗糖量為36.73 g/L，BC產(chǎn)量為12.81 g/L，葡萄糖酸生成量為32.25 g/L。進(jìn)一步說(shuō)明菌體在合成BC時(shí)，有大量的葡萄糖酸副產(chǎn)物生成[18]，造成碳源的浪費(fèi)。并且，大量的酸會(huì)降低發(fā)酵液的pH，對(duì)菌體生長(zhǎng)不利[19]。因此，對(duì)菌體進(jìn)行改造，減少副產(chǎn)物的生成對(duì)提高BC產(chǎn)量至關(guān)重要。

2.3 K.rhaeticus 315葡萄糖脫氫酶基因缺失體的構(gòu)建

葡萄糖酸(GA)是葡萄糖在葡萄糖脫氫酶(gcd，WP_110094965.1和WP_003620475.1)的作用下產(chǎn)生的。為了減少GA的生成，使葡萄糖代謝流向BC合成途徑，本研究通過(guò)敲除GA合成關(guān)鍵酶的基因，來(lái)減少副產(chǎn)物GA的生成。首先選擇敲除gcd(WP_003620475.1)這一基因，構(gòu)建gcd-重組菌株。

2.3.1片段融合

首先利用PCR分別擴(kuò)增gcd基因(WP_003620475.1)的左臂、右臂以及Km基因。如圖5a所示，電泳條帶顯示三段基因全都擴(kuò)增成功，條帶大小為900 bp。再將已擴(kuò)增完成的三段基因融合。圖5b說(shuō)明三段基因連接成功，融合片段大小為2 500 bp。

2.3.2同源重組

采用電脈沖法，將2.3.1融合成功的片段轉(zhuǎn)入K.rhaeticus315感受態(tài)中進(jìn)行同源重組。利用卡那霉素抗生標(biāo)記篩選目的菌株gcd-重組株，并用驗(yàn)證引物(表1)進(jìn)行驗(yàn)證，驗(yàn)證片段的大小為1 000 bp左右。如圖6所示，片段轉(zhuǎn)化成功，即gcd-重組菌株構(gòu)建成功。

2.3.3gcd-重組菌株的發(fā)酵

將未電轉(zhuǎn)的原始菌株與gcd-重組菌株靜置發(fā)酵4 d，觀察BC干重及GA生成量。如表3所示，gcd-重組菌株的GA生成量顯著下降，比原始菌株降低了7.93 g/L，降低了77%。但BC干重?zé)o明顯提高，推測(cè)是單純敲除一個(gè)gcd基因在有限的發(fā)酵時(shí)間內(nèi)體現(xiàn)不出其節(jié)約BC合成前體—葡萄糖的優(yōu)勢(shì)；另一方面基因的敲除可能會(huì)影響菌體的其他代謝功能。

M: DNA marker；Y: 驗(yàn)證片段圖6 驗(yàn)證片段瓊脂糖凝膠電泳圖

表3 gcd基因敲除后對(duì)發(fā)酵的影響

3 結(jié)論

本研究對(duì)新篩選的BC生產(chǎn)菌株K.rhaeticus315進(jìn)行了全基因組測(cè)序及簡(jiǎn)單分析。通過(guò)基因信息及代謝途徑分析，K.rhaeticus315是通過(guò)PPP和TCA途徑來(lái)代謝碳源，維持菌體生長(zhǎng)和代謝。當(dāng)葡萄糖作為碳源時(shí)，菌體會(huì)產(chǎn)生大量的葡萄糖酸，造成葡萄糖的浪費(fèi)。因此，通過(guò)全基因組序列找到葡萄糖合成葡萄糖酸途徑中的關(guān)鍵基因gcd，對(duì)該基因進(jìn)行敲除，可使葡萄糖酸降低了77%。本研究?jī)H對(duì)K.rhaeticus315做了簡(jiǎn)單分析和改造，后續(xù)可利用該基因組信息進(jìn)行進(jìn)一步的分析和操作。