張 潮 黎珍妹 趙紅玲 李 雯 余紅蕾

咸寧市中心醫(yī)院 湖北科技學(xué)院附屬第一醫(yī)院兒科（湖北咸寧 437100）

人類大腦皮層的發(fā)育是一個(gè)復(fù)雜而精密的過程，發(fā)育過程中任何一環(huán)節(jié)出現(xiàn)問題均可以引起發(fā)育落后、智力低下、癲癇發(fā)作等一系列的臨床表現(xiàn)[1]。而神經(jīng)元移行相關(guān)基因突變是大腦皮層發(fā)育不良（malformation of cortical development，MCD）的重要原因[2]。研究發(fā)現(xiàn)，Reelin-LIS1-Tubulins信號(hào)通路可調(diào)控神經(jīng)元移行，該通路上的多個(gè)基因異?？蓪?dǎo)致不同類型的MCD，其中TUBA1A基因編碼微管相關(guān)蛋白，該基因突變可導(dǎo)致平滑腦畸形、小頭畸形以及多小腦回畸形等[3-4]。TUBA1A基因變異導(dǎo)致的MCD國(guó)內(nèi)未見報(bào)道，現(xiàn)報(bào)告2例TUBA1A基因變異導(dǎo)致的MCD患兒的臨床資料，并復(fù)習(xí)相關(guān)文獻(xiàn)，探討其臨床特點(diǎn)。

1 臨床資料

例1，男，1歲3個(gè)月，確診癲癇1個(gè)月，3天內(nèi)再次發(fā)作10余次就診?；純?個(gè)月前無明顯誘因突發(fā)抽搐，強(qiáng)直陣攣發(fā)作，具體表現(xiàn)為雙眼凝視、口唇面色發(fā)紺，口吐白沫，四肢強(qiáng)直，意識(shí)喪失，約1～2分鐘自行緩解，緩解后精神狀態(tài)差?？紤]癲癇給予左乙拉西坦，早晚各1.5 mL(約37.5mg/kg·d)，用藥后無抽搐發(fā)作。3天前患兒再次出現(xiàn)抽搐，3～5次/d，發(fā)作表現(xiàn)與之前類似，門診以癲癇收入院?；純簽镚2P2，足月剖宮產(chǎn)，出生體質(zhì)量3.1 kg?；純赫w發(fā)育落后，獨(dú)站不穩(wěn)，精細(xì)動(dòng)作明顯落后同齡兒童。入院體格檢查：面容無異常，神志清楚，頸軟，呼吸運(yùn)動(dòng)對(duì)稱，心臟各聽診區(qū)未聞及雜音，肌張力偏低，布氏征陰性。實(shí)驗(yàn)室檢查：血常規(guī)、肝腎功能均未見異常，血氨基酸代謝物未見明顯異常。腦電圖示有癲癇波發(fā)放。頭顱磁共振成像（MRI）示神經(jīng)元移行障礙（平滑腦、巨腦回）。見圖1?；純撼鲈汉箅S訪暫未出現(xiàn)癲癇發(fā)作。

例2，女，6月齡，因間斷抽搐3天入院?；純簾o明顯誘因出現(xiàn)抽搐，表現(xiàn)為突然點(diǎn)頭、上肢內(nèi)收，成串發(fā)作；四肢無明顯抖動(dòng)及強(qiáng)直，口唇面色無明顯異常，癥狀持續(xù)數(shù)秒至2分鐘左右，無發(fā)熱、無吐瀉?；純簽镚2P1，足月剖宮產(chǎn)，出生體質(zhì)量3.4 kg，發(fā)育無明顯異常，無特殊疾病史，無類似疾病家族史。入院體格檢查：面容無異常、神志清楚、全身皮膚未見皮疹；雙肺呼吸音稍粗，未聞及干濕性啰音；心率齊，未聞及病理性雜音；腹部無異常；四肢未見異常且活動(dòng)不受限，肌張力無異常，四肢肌力四級(jí)，布氏征及巴氏征陰性。腦電圖示異常幼兒腦電圖，高度失律并檢測(cè)到孤立或成串痙攣發(fā)作。MRI示雙側(cè)額頂葉巨腦回畸形（圖1）?；純喝朐汉笥杩诜滋┘伴_普蘭治療，未見好轉(zhuǎn)；隨后加抗癲癇藥物德巴金并予以靜脈滴注ACTH一周（因肺炎停用），之后2 個(gè)月偶有發(fā)作。目前患兒使用潑尼松龍治療，抗癲癇藥物為丙戊酸鈉早晚4 mL，約30mg/（kg·d）；托吡酯早晚各12.5 mg，定期隨訪中。

為進(jìn)一步明確診斷及尋找病因，經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會(huì)審核及家屬知情同意后，分別采集患兒及家屬的外周靜脈血各2 mL，利用全血基因組DNA提取試劑盒（天根生物）提取基因組DNA，委托第三方公司進(jìn)行全外顯子測(cè)序，并利用Sanger測(cè)序驗(yàn)證。致病基因TUBA1A的引物由上海生工合成。經(jīng)過高通量測(cè)序以及Sanger 測(cè)序驗(yàn)證后發(fā)現(xiàn)，例1 的TUBA1A基因存在c.387 C＞A 雜合突變，該突變導(dǎo)致該基因編碼的蛋白第129 位氨基酸由半胱氨酸突變?yōu)榻K止密碼子（p.C 129 X）；患兒父母該位點(diǎn)未見異常，見圖2。例2的TUBA1A基因存在c.848 A＞G 雜合突變，該突變導(dǎo)致該基因編碼的蛋白第283位氨基酸由組氨酸突變?yōu)榫彼幔╬.H283R），患兒父母該位點(diǎn)未見異常，見圖2。

圖1 患兒頭顱MRI 表現(xiàn)

圖2 2 例患兒TUBA1A 基因測(cè)序圖

2例患兒TUBA1A基因存在的2種突變，c.387C＞A和c.848 A＞G 均未見報(bào)道。其中c.387 C＞A 為無義突變，依據(jù)ACMG指南為致病性改變（PVS1，LOF變異可能導(dǎo)致基因功能喪失；PS2：新發(fā)突變，無家族史；PM1：數(shù)據(jù)庫(kù)未收錄，屬于低頻變異）。c.848A＞G為錯(cuò)義突變，Polyphen2及SIFT軟件預(yù)測(cè)突變影響蛋白質(zhì)的功能不同物種間蛋白序列保守性分析發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)十分保守，見圖3。依據(jù)ACMG 指南該突變?yōu)榭赡苤虏⊥蛔儯≒S2：雙親驗(yàn)證的新發(fā)突變；PM2：EXaC及其他人群數(shù)據(jù)庫(kù)未見收錄；PP3多種軟件預(yù)測(cè)有害）。

取患者新鮮靜脈血1 mL，裂解紅細(xì)胞后得到白細(xì)胞，利用Trizol 方法提取總RNA，經(jīng)過反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，利用TUBA1A基因特異性生物引物進(jìn)行相對(duì)定量分析，結(jié)果顯示相對(duì)于正常對(duì)照，例1的TUBA1A基因表達(dá)水平顯著下降，例2表達(dá)水平未見明顯異常，見圖4。

圖3 突變位點(diǎn)在蛋白結(jié)構(gòu)中的位置以及c.848A＞G（p.H283R)保守性分析

圖4 患兒及同齡健康兒童靜脈血中TUBA1A 基因mRNA 水平

2 討論

人體中樞神經(jīng)系統(tǒng)正常發(fā)揮功能需要腦發(fā)育早期的兩個(gè)重要的事件：神經(jīng)元干細(xì)胞的生長(zhǎng)分化以及特定的神經(jīng)元在特定的時(shí)間內(nèi)移行到目的區(qū)域并彼此交聯(lián)發(fā)揮正常功能[5]。腦皮層的多層結(jié)構(gòu)就是神經(jīng)元正常移行形成的，否則會(huì)導(dǎo)致腦皮質(zhì)發(fā)育畸形[6]。神經(jīng)元移行相關(guān)基因變異是導(dǎo)致大腦皮層發(fā)育不良的重要原因。研究發(fā)現(xiàn)，LIS1基因以及DCX基因異常可導(dǎo)致經(jīng)典型的平滑腦畸形，ARX基因突變可導(dǎo)致X連鎖平滑腦畸形伴生殖器異常；FLNA以及ARGEF2基因缺陷可導(dǎo)致腦室周圍灰質(zhì)異位以及可調(diào)控神經(jīng)元移行的Reelin-LIS1-Tubulins信號(hào)通路上的多種基因突變可導(dǎo)致MCD[1,7-9]。

本組2 例患兒均以間斷抽搐入院治療，面容均未見異常，入院后生化檢測(cè)未見明顯異常，血氨基酸代謝未見異常。2 例患兒的腦電圖均存在異常，高度失率或者癲癇波發(fā)放。例1 頭顱MRI 提示平滑腦、巨腦回畸形，例2 頭顱MRI 示雙側(cè)額頂葉巨腦回畸形；均存在MCD的癥狀。全外顯子測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)，2例患兒TUBA1A基因均存在變異，例1為無義突變（p.C129X），導(dǎo)致編碼的蛋白質(zhì)提前終止而不能行使正常功能；例2為錯(cuò)義突變（p.H283R），因TUBA1A蛋白在不同物種間十分保守，推測(cè)變異影響蛋白的正常功能。

TUBA1A基因位于12 號(hào)染色體q 13.12 區(qū)域，全長(zhǎng)4530 bp，編碼含有451 個(gè)氨基酸的α 微管蛋白，該蛋白分為三個(gè)結(jié)構(gòu)域，分別為N 端結(jié)構(gòu)域、中間以及C 端結(jié)構(gòu)域[10]。所有真核生物中都有α、β 和γ微管蛋白家族的基因，α 和β 微管蛋白是微管的主要成分。近年發(fā)現(xiàn)，越來越多的微管相關(guān)的基因（如TUBA1A、TUBA8、TUBB2A、TUBB3、TUBB、TUBB2B等）可導(dǎo)致微管疾病，該類疾病臨床表現(xiàn)為巨腦回畸形、多小腦回畸形、胼胝體發(fā)育不良、小頭畸形、智力低下等一系列癥狀[11-13]。

文獻(xiàn)報(bào)道，超過95%的TUBA1A基因突變患者有大腦皮層發(fā)育異常的特征，其中約70% 患者為無腦回/巨腦回畸形，約18%存在多小腦回畸形癥狀。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)TUBA1A基因異常可能與基底節(jié)、胼胝體以及小腦蚓部異常相關(guān)[14]。TUBA1A基因異常導(dǎo)致患者的臨床表型多樣：超過90%的患者存在全面發(fā)育遲緩，約70%存在小頭畸形、70%存在不同類型的癲癇發(fā)作，約40%肌張力減退，此外少數(shù)存在面容異常、斜視、眼球震顫以及視神經(jīng)發(fā)育不全等[14]。本組2例患兒存在MCD、癲癇以及發(fā)育落后等與國(guó)外報(bào)道一致。

進(jìn)一步檢索文獻(xiàn)及數(shù)據(jù)庫(kù)發(fā)現(xiàn)，目前共計(jì)收錄TUBA1A基因121 個(gè)突變，絕大多數(shù)為錯(cuò)義突變，其中第420（R402）位以及264（R264）位氨基酸為熱點(diǎn)突變位置，20%以上的患者可檢測(cè)到以上兩個(gè)熱點(diǎn)突變[14-15]。在TUBA1A蛋白的三維結(jié)構(gòu)模型中發(fā)現(xiàn)，約40%的致病性突變影響蛋白與其他微管相關(guān)蛋白之間或者動(dòng)力蛋白之間的結(jié)合作用。本組例1患兒存在無義突變（p.C 129 X），導(dǎo)致氨基酸編碼提前終止，定量PCR 顯示TUBA1A的RNA 水平明顯降低，推測(cè)變異影響蛋白表達(dá)量，進(jìn)而影響功能。例2 攜帶錯(cuò)義突變（p.H283R），雖變異未影響mRNA水平，推測(cè)變異的蛋白與其他微管蛋白的結(jié)合作用變?nèi)?，進(jìn)而導(dǎo)致臨床表型。遺憾的是，本組2例患兒未檢測(cè)TUBA1A蛋白的表達(dá)水平；未在細(xì)胞水平進(jìn)一步證實(shí)突變對(duì)TUBA1A蛋白功能的影響。

綜上所述，TUBA1A基因突變導(dǎo)致一系列臨床表型，包括大腦結(jié)構(gòu)發(fā)育異常、整體發(fā)育落后，癲癇發(fā)作、肌張力異常以及面容、視力異常等，臨床診斷較為困難。本組2 例TUBA1A基因異常導(dǎo)致MCD 患兒經(jīng)分子診斷確診，且這2 個(gè)變異尚未見報(bào)道，豐富了TUBAIA基因突變數(shù)據(jù)庫(kù)。