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        5 例低磷酸酯酶癥患兒臨床及遺傳學(xué)分析

        2020-04-27 05:37:54張惠姣
        臨床兒科雜志 2020年4期
        關(guān)鍵詞:證者外顯子基因突變

        蘇 娜 朱 岷 許 珂 張惠姣

        1.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院兒科研究所 兒童發(fā)育疾病研究教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 國(guó)家兒童健康與疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心 兒童發(fā)育重大疾病國(guó)家國(guó)際科技合作基地 兒科學(xué)重慶市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(重慶 400014);2.電子科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬婦女兒童醫(yī)院成都市婦女兒童中心醫(yī)院兒童遺傳與內(nèi)分泌代謝科(四川成都 610019)

        低磷酸酯酶癥(hypophosphatasi,HPP,OMIM 146300,241500,241510)是以骨和/或牙齒礦化障礙,血清中組織非特異性堿性磷酸酶(tissue non-specific alkaline phosphatase,TNSALP)活性降低為主要臨床特征的一種罕見遺傳性疾病,1935 年首次報(bào)道,由加拿大兒科醫(yī)師Rathbun命名,故又稱Rathbun綜合征。輕型可僅表現(xiàn)為牙齒過(guò)早脫落、牙齒骨量減少、牙髓腔變大,而無(wú)骨骼異常表現(xiàn),重型HPP 可出現(xiàn)嚴(yán)重骨骼異常、癲癇發(fā)作、繼發(fā)嚴(yán)重感染、呼吸衰竭及高鈣血癥而引發(fā)死亡,發(fā)病率1/300000~1/100000[1-2]。

        HPP是由于編碼組織TNSALP的ALPL(the liver/bone/kidney alkaline phosphatase gene)基因突變所致,其遺傳方式較為復(fù)雜,在家系內(nèi)以常染色體顯性或隱性遺傳。ALPL基因位于lp 36.1-p 34 上,包含12 個(gè)外顯子,編碼一種磷酸單酯酶TNSALP,后者由524個(gè)氨基酸組成,包含活性區(qū)、N端螺旋區(qū)、同型二聚體結(jié)合區(qū)、冠狀區(qū)及鈣結(jié)合位點(diǎn)5 個(gè)結(jié)構(gòu)域[3],以同型二聚體的形式通過(guò)C 端的糖基磷脂酰肌醇(glycophosphatidylinositol,GPI)錨點(diǎn)與細(xì)胞膜鏈接,定向使得活性位點(diǎn)面向胞外環(huán)境[4],廣泛存在于各種組織中,尤以骨骼、肝臟、腎臟和發(fā)育中的牙齒分布較多。任何引起蛋白質(zhì)表達(dá)、折疊、修飾、轉(zhuǎn)運(yùn)異常的ALPL基因突變,均可引起TNSALP量和質(zhì)的改變,從而引起HPP[5]。但TNSALP在骨骼和牙齒礦化中的具體機(jī)制還不十分明確[6]。本文回顧分析5例HPP患兒的臨床資料,以及高通量測(cè)序分析結(jié)果。

        1 臨床資料

        5 例HPP 患兒中,男3 例、女2 例,年齡在6 天~2歲5 個(gè)月,其中3 例為嬰兒型HPP,以骨骼畸形、骨礦化不全(圖1)及驚厥為主要臨床表現(xiàn);2 例為兒童型HPP,以身材矮小、牙齒排列紊亂、骨質(zhì)疏松、長(zhǎng)骨干骺端杯口樣改變(圖2)為主要臨床癥狀。5 例HPP 患兒的具體臨床資料見表1。

        經(jīng)醫(yī)學(xué)倫理審核及父母知情同意,采集患兒及其父母的外周血樣,送第三方檢測(cè)公司進(jìn)行人類全外顯子組高通量測(cè)序。采用Illumina TruSeq Exome library prep kit 捕獲全基因組構(gòu)建測(cè)序文庫(kù),HiSeq v 4 SBS 250 cycles測(cè)序試劑盒,HiSeq 2500測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。所得的測(cè)序數(shù)據(jù)經(jīng)生物信息分析,致病性預(yù)測(cè)(SIFT、Polyphen 2、MutationTaster、PROVEAN 等軟件),患兒臨床癥狀對(duì)照與家系遺傳分析,相關(guān)疾病數(shù)據(jù)庫(kù)與文獻(xiàn)查閱,候選基因突變位點(diǎn)根據(jù)ACMG(American College of Medical Genetics)、AMP(American Society of Molecular Pathology)指南進(jìn)行分類,并進(jìn)行一代測(cè)序(Sanger法)驗(yàn)證。

        表1 5例HPP患兒及親屬臨床資料

        圖1 先證者1 影像表現(xiàn)

        圖2 先證者3 影像表現(xiàn)

        5 例HPP 患兒經(jīng)過(guò)測(cè)序共鑒定出6 個(gè)ALPL基因突變位點(diǎn)(表2)。行Sanger 驗(yàn)證,先證者1 為雜合突變,突變來(lái)自母親;先證者2、3為復(fù)合雜合突變,常染色體隱性遺傳,父母均為攜帶者;先證者4純合突變,常染色體隱性遺傳,父母均為攜帶者;先證者5 位雜合突變,常染色體顯性遺傳,父親為患者,突變來(lái)自父親,見圖3。未發(fā)現(xiàn)新生突變(denovomutation)。6 個(gè)突變位點(diǎn)中c.1014_c.1015 ins G、c.1097_c.1099 del CCT、c.1446 C>A 在千人數(shù)據(jù)庫(kù)、dbSNP 數(shù)據(jù)庫(kù)及hapmap數(shù)據(jù)庫(kù)中未查及相關(guān)記載,為首次報(bào)道,蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)均為可能有害,ACMG評(píng)級(jí)為可能致病。

        圖3 ALPL 基因測(cè)序結(jié)果

        2 討論

        HPP 臨床異質(zhì)性強(qiáng),輕型易造成漏診和誤診,重型可危及生命。目前臨床分6 型:圍生期型、嬰兒型、兒童型、成年型、牙型。據(jù)國(guó)外文獻(xiàn)報(bào)道,TNSALP水平降低導(dǎo)致磷酸吡哆醛(pyridoxal phosphate,PLP)的積累[7]可能會(huì)導(dǎo)致一些HPP嬰兒和實(shí)驗(yàn)敲除ALPL基因小鼠癲癇發(fā)作。故嬰兒型HPP多在生后 6個(gè)月內(nèi)出現(xiàn)以驚厥等神經(jīng)系統(tǒng)癥狀為主的臨床表現(xiàn)[8-9],同時(shí),驚厥也是重型HPP神經(jīng)系統(tǒng)的首要表現(xiàn)[9],死亡率高達(dá)50%~90%。本研究中3 例嬰兒型HPP 具有驚厥等神經(jīng)系統(tǒng)表現(xiàn),死亡率100%。由此可見,面對(duì)驚厥的患兒,尤其是不明原因反復(fù)驚厥,并伴有骨骼異常的患兒,臨床醫(yī)師應(yīng)高度警惕HPP,并多方搜尋證據(jù),全面分析。

        表2 ALPL基因突變位點(diǎn)及Sanger驗(yàn)證

        目前,HPP 臨床診斷參考指標(biāo)包括:①血清堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)持續(xù)顯著降低,且臨床癥狀越重的患者,ALP 活性也越低[9],但早孕、甲狀腺功能減退、貧血等患者也可出現(xiàn)ALP 降低,缺乏特異性;②尿磷酸乙醇胺(phosphoethanolamine,PEA),TNSALP 參與PEA 的代謝,作為代謝底物,PEA 容易檢測(cè),但缺乏特異性,一些骨代謝疾病可出現(xiàn)尿PEA 陽(yáng)性;③胎兒超聲,主要針對(duì)圍生期HPP;④X 線檢查示嚴(yán)重骨礦化不足,前臂或股骨突出皮膚的軟骨樣骨刺,對(duì)HPP 具有診斷意義;⑤針對(duì)有HPP家族史的高危人群或臨床疑診HPP患者的ALPL基因檢測(cè)可增加HPP 診斷的準(zhǔn)確性。目前,通過(guò)基因檢測(cè)可篩查出 95%的HPP 重癥患者[10],是比血清ALP 檢測(cè)更可靠的診斷指標(biāo)。根據(jù)ALPL基因突變數(shù)據(jù)庫(kù)的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)(http://www.sesep.uvsq.fr/03_hypo_mutations.php),截至2019年10月2日,共報(bào)告397 種引起疾病的突變。最普遍的突變類型是錯(cuò)義突變,占所有突變的70.0%,其次是小缺失,占11.8%。據(jù)筆者統(tǒng)計(jì),目前國(guó)內(nèi)已報(bào)道ALPL基因突變42 種,78.57%為錯(cuò)義突變。在除1 號(hào)外顯子以外的所有外顯子區(qū)域均有分布[11-15],主要分布在5、10、12號(hào)外顯子,分別都有6種突變,同時(shí),國(guó)內(nèi)已報(bào)道的病例中有6 例存在c.407位點(diǎn)的不同突變,是否存在突變熱點(diǎn),尚需大樣本多中心數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析。此次發(fā)現(xiàn)的突變中4例為錯(cuò)義突變,1例小缺失,1例插入突變。

        HPP的基因型和表型的變化都非常大,同一突變的不同患者輕重表型也不一致。本組患兒中先證者1的突變位點(diǎn)為c.346 G>A,此位點(diǎn)突變的致病性既往已有報(bào)道,為齒型HPP,屬常染色體顯性遺傳[16],研究者還發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)突變具有顯性負(fù)效應(yīng)[17]。本研究中,先證者1的母親與先證者1的基因型相同,但患兒母親僅有ALP 水平降低、骨痛和關(guān)節(jié)脫位等表現(xiàn),為成人型輕型HPP,而患兒的臨床表現(xiàn)屬于嬰兒型重型HPP,臨床表現(xiàn)型并不一致,分析可能與環(huán)境因素與個(gè)體差異所致外顯不全有關(guān)。據(jù)既往報(bào)道,重型HPP多呈常染色體隱性遺傳,但先證者1 的家系遺傳學(xué)分析呈常染色體顯性遺傳,其生物學(xué)意義與家系遺傳學(xué)并不相符,分析可能與內(nèi)含子調(diào)控區(qū)域的測(cè)序盲區(qū)有關(guān),同時(shí)環(huán)境因素與個(gè)體差異的作用不能除外,這有待進(jìn)一步研究。與此同時(shí),先證者3 分別攜帶了來(lái)自父親的c.1446C>A和母親的c.1014至c.1015:插入G突變,為復(fù)合雜合突變,根據(jù)其年齡和臨床表現(xiàn)診斷為兒童型輕型HPP,屬輕型。但其父母均為突變攜帶者且無(wú)臨床癥狀,故其遺傳方式符合常染色體隱性遺傳。因此在遺傳咨詢上,需警惕少數(shù)患兒盡管合并有兩個(gè)突變,但臨床表現(xiàn)型為輕型HPP的可能。先證者2及先證者3攜帶的c.1014_c.1015ins G、c.1097_c.1099del CCT、c.1446C>A在千人數(shù)據(jù)庫(kù)、dbSNP數(shù)據(jù)庫(kù)及hapmap 數(shù)據(jù)庫(kù)中未查及相關(guān)記載,為首次報(bào)道,蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)均為可能有害,ACMG 評(píng)級(jí)為可能致病,目前正在進(jìn)行體外細(xì)胞功能驗(yàn)證。

        綜上所述,對(duì)于臨床疑診HPP 患兒,應(yīng)首先檢測(cè)血清ALP水平,若血清ALP水平持續(xù)顯著下降,需進(jìn)一步進(jìn)行ALPL基因檢測(cè),不僅有利于HPP 的早期診斷,也為患兒家庭進(jìn)行遺傳咨詢和產(chǎn)前診斷提供重要的理論依據(jù)。目前,HPP 發(fā)病機(jī)制的研究已經(jīng)取得很大進(jìn)步,但輕型HPP 的患病率、臨床表型與基因型的相關(guān)性及調(diào)控機(jī)制,尚不明確,ALPL基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)及內(nèi)含子區(qū)域的突變對(duì)蛋白質(zhì)功能的影響等許多問(wèn)題仍需要進(jìn)行深入研究。

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